073182117020 谭家祺学位论文_
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谭家祺学位论文

作者:
发布日:2010/7/25 16:57:30

 

 

分类号

 

密级

 

 

国际十进分类号(UDC

 

 

第四军医大学

学位论文

兔坐骨神经电损伤后背根神经节钠钾离子通道表达变化的研究

 

 

 

 

(题名和副题名)

 

谭家祺

 

 

(作者姓名)

 

指导教师姓名

李学拥  教授(主医师)

指导教师单位

第四军医大学唐都医院整形烧伤科

申请学位级别

硕士

专业名称

外科学(烧伤)

论文提交日期

2009.04

答辩日期

2009.05

论文起止时间

20069月至20095

学位授予单位

第四军医大学

 

 

秉承学校严谨的学风与优良的科学道德,本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。

申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。

 

           论文作者签名:            日期:              

 

 

本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容(含电子版,保密内容除外),可以采用影印,缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅,并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》和编入《中国知识资源总库》,同意按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。

 

   论文作者签名:         导师签名:           日期:           

 


 

 

 

兔坐骨神经电损伤后背根神经节钠钾离子

通道表达变化的研究

 

 

 

 

生:谭家祺        

学科专业:外科学(烧伤)

所在单位:第四军医大学唐都医院烧伤科

    师:李学拥  教授(主医师)

辅导教师: 陈绍宗  教授

  李跃军  副教授

 

 

 

资助基金项目:国家自然科学基金   30672180

关键词: 电损伤  背根神经节  离子通道

 

 

中国人民解放军第四军医大学

20095



 

缩略语表

 

缩略词

英文全称

中文全称

BSA

bovine serum albumin

牛血清白蛋白

CCD

chronic compression of the dorsal root ganglion

慢性压迫背根神经节

CCI

chronic constriction injury

慢性压缩性损伤

CGRP

Calcitonin gene-related peptide

降钙素基因相关肽

DRG

Dorsal root ganglion

背根神经节

IHC

Immunohistochemistry

免疫组织化

Kv        

voltage-gated sodium channel

电压门控钾通

Nav

voltage-gated sodium channel

电压门控钠通

NGF    

Nerve Growth Factor

神经生长因子

NMDA

N-methyl- D-aspartate

N-甲基-D-天冬氨酸

MCP-1 

Monocyte Chemotactic Protein-1  

单核细胞趋化蛋白-1

PBS

phosphate buffered solution

磷酸盐缓冲溶液

SNL

spinal nerve ligation

脊神经结扎

SNS

small—diameter sensory neuron

小直径感觉神经元

nNOS

neuronal nitric oxide synthase

神经元型一氧化氮合酶

 

 


 

兔坐骨神经电损伤后背根神经节离子通道

表达变化的研究

 

硕士研究生

:谭家祺

     

:李学拥  教授

第四军医大学唐都医院整形烧伤科,西安 710038

 

中文摘要

背景  近年来电损伤病人有增多的趋势,目前已占烧伤病人总数的8%,截肢率高达64.5%。在电损伤病例中周围神经是损伤修复与重建周期最长,恢复最困难的组织,周围神经电损伤后的修复成为现代电损伤研究的方向。电压依赖性离子通道是神经元和其他可兴奋细胞赖以产生可传导电信号的结构基础,在神经系统内控制着信号传导许多方面,这些通道结构上细微的改变均会影响神经功能的正常。神经电损伤时,势必将引起相应背根神经节(DRG)细胞膜上大分子蛋白的构像改变。本课题计划以DRG离子通道为切入点,研究在周围神经电损伤后DRG离子通道表达水平变化,通过研究电损伤后DRG细胞膜上大分子蛋白的作用,尤其是离子通道在神经电损伤后的溃变和再生过程中的分布和结构的改变以及这些变化对神经功能改变的影响,从分子水平反映神经的损伤程度和离子通道的变化情况,掌握电损伤后离子通道损伤与神经功能异常之间的规律。

实验一 兔坐骨神经实验性电损伤后背根神经节神经元细胞离子通道SCN9AKv1.5多克隆抗体的免疫组化观察

目的:通过免疫组化方法研究兔坐骨神经电损伤后背根神经节神经元细胞离子通道SCN9AKv1.5的表达变化。

方法 本研究采用100只健康成年中国家兔分为阴性对照组、50V110V220V 4个电损伤组,取标本时间分为立即组、4周组,用免疫组织化学方法半定量分析DRG上钠钾离子通道SCN9AKv1.5的表达变化。

结果 电损伤后立即与4周后背根神经节(DRG)上离子通道的的表达降低,且与电压呈负相关,220V4周时无明显恢复。

结论 离子通道在神经电损伤后的溃变程度和再生恢复取决于电压和时间。

实验二 家兔坐骨神经不同电压电损伤后背根神经节内电压依赖性钾钠离子通道mRNA表达水平变化研究

目的 了解不同电压电击前后电压依赖性钾离子通道和电压依赖性钠离子通道在背根神经节的表达。

方法 随机将家兔分成5组:对照组,50V100V150V200V电击组,每组3只,电击家兔坐骨神经。一周后,取腰椎4-6区段背根神经节,应用RT-PCR方法检测其中Kv1.2α, Kv1.4α, Kv1.5Kv11.1Nav1.1βNav1.7α型通道mRNA表达量的变化。

结果:电击组Kv1.2α Kv1.4αKv1.5αNav1.1βNav1.7α mRNA表达量下降,Kv总和Nav总均有所下降,Kv11.1α水平提高;而且随着电击电压的增高,表达水平下变化更显著。

结论:KvNav参与了背根神经节对周围传入信息的传递和调制,周围神经电损伤后,相应背根神经节内电压依赖性钾钠离子通道表达水平的变化可能是电损伤发生的分子机制。

 

关键词: 电损伤  背根神经节  离子通道

 


 

Study of the Dorsal Root Ganglion Ion Channel Expression of the Sciatic Nerves in Rabbit after Electrical Injury

Candidate for master: TAN Jiaqi

Supervisor: LI Xueyong

Department of Plastics and burns, Tangdu hospital, Fourth Military Medical University,

Xi’an 710038, China

 

Abstract

Background: Recently, the incidence of the patient damaged by electrical current has been increasing.which has accounted for 8% of the burn patient, and its amputation rate reached as high as 64.5%. In the electrical injury cases, peripheral nerve is the most difficult recovery tissue. So the peripheral nerve recovery has become the modern electrical injury research trend recently. Voltage-gated ion channels are the structure foundations of neurons and other excitability cells to generate electrical signal, even impalpable changes on these channels’ structure will affect the neural function. When the electrical injury happens, the structure will be changed, which of corresponding dorsal root ganglion (DRG) neurons membrane macromolecular proteins. Our experiment is study the changes of ion channels after the peripheral nerve was electrical injury. According to study the effect of current to membrane macromolecular protein, especially the degeneration and regeneration process of channel after electrical injury, we could see about the contribution of neuronfunctional changes. This can reveal the injury degree of nerve at protein and molecular level. From the research, we want to probe the situation of DRG ion channels after electrical injury, and master the relationship between the harms of channels after electrical injury and the disfunctions of nerves.

Part I: Immunohistochemistrical study of dorsal root ganglion ion channel submits SCN9A, Kv1.5 polyclonal antibody in rabbit peripheral nerve after electrical injury

Objective: To study dorsal root ganglion ion channel submits SCN9A, Kv1.5 expression changes when peripheral nerve after electrical injury.

Methods: The experimental animals were randomized into 4 groups according to the electrical voltage: the control group, the 50v group, the 110v group, and the 220v group. And samples were obtained instantly, 4weeks. The model of the rabbit sciatic nerve with electrical injury was set up. Immunohistochemistry in semi quantitative analysis was detected the DRG ion channels expression.

Results: After the electrical injury, the DRG ion channel expression is in a decreasing order, furthermore, it is inverse correlation with voltage and time. The 220v group has not obvious recovery after 4 weeks.

Conclusions:  The degeneration and regeneration progress of ion channel after electrical injury, depend on voltage and time.

Part II: Expression changes of potassium channels and sodium channels of peripheral nerve in rabbit after electrical injury

Objective: To study the expression level of voltage-gated potassium channels and voltage-gated sodium channels after electrical injury of different voltages.

Methods: The sciatic nerves of rabbits were respectively injured by 50V, 100V, 150V and 200V alternating current. One week later, the mRNA expression levels of Kv1.2, Kv1.4, Kv1.5, Kv11.1, total Kv, Nav1.1, Nav1.7 and total Nav were tested as they were identified as PCR products from mRNA prepared from DRG neurons.

Results: In general, the tendency of Kv1.2, Kv1.4, Kv1.5, Nav1.1, Nav1.7, total Kv and total Nav mRNA expression was decreasing; the tendency of Kv11.1 mRNA expression was increasing after electrical injury.

Conclusions: The mRNA expression levels of voltage-gated potassium channels and voltage-gated sodium channels are changed after electrical injury.

 

Keywords: voltage gated potassium channel; voltage gated sodium channel; electrical injury; peripheral nerve; dorsal root ganglion; 


   

随着电能在人类的生产、生活上应用日益广泛,电流损伤人体的事故也日渐增多,全世界每年有许多人因触电致死或致残。流行病学调查可知,美国、加拿大的电损伤病人占同期收治烧伤病人总数的3-4%,国内电损伤约占住院烧伤病人的8[12];在急性电损伤病人中周围神经损伤的发生率高达29%[3] ,截肢率高达64.5%电损伤与普通烧伤在作用机理、病理变化、组织溃变再生过程等诸多方面不同,而目前对周围神经电损伤机理的研究等方面尚存在很大不足,因此有必要对其损伤机理及转归进行研究。

神经因电阻低而易受到电流的损害,其损伤特点是神经连续性没有破坏但细胞膜因热和电流作用而受损,给神经溃变与再生提供了较其他类型损伤不同的先决条件。临床上对于这类型的神经损伤还没有较好的治疗方案,基础研究主要涉及电损伤后神经电生理和形态结构改变,对于这些改变的分子生物学机制尚没有深入研究。

因此,以神经电损伤后轴突膜上大分子蛋白(电压门控性离子通道)的变化为切入点,研究电损伤后神经的溃变与再生规律,有可能揭示这些改变的物质基础,探索电损伤后病理改变的分子机制,丰富电损伤和周围神经损伤理论,为临床治疗提供实验依据。



文献回顾

临床上由于各种病因导致的周围神经系统受损而出现疑难病例并不少见。脊髓背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)是躯体初级感觉传入的细胞体聚集处,当兴奋到达时,细胞膜上的电压门控性离子通道的内向电流是神经元动作电位产生和传导的基础[4]DRG是感觉传入第一级神经元,属于假单极感觉神经元,胞体发出单个轴突在节内延伸一段长度后分为两支:一支为周围神经的轴突,伸向周围组织,接受感觉信息;另一支为中枢轴突,将周围传入信息送至脊髓背角,完成初级感觉信息的传递。电压依赖性离子通道是神经元和其它可兴奋细胞赖以产生可传导电信号的结构基础,在神经系统内控制着信号转导许多方面, 这些通道结构上细微的改变均会影响神经功能的正常[5]DRG神经元中存在几乎所有的各种离子通道,它们对感觉信号起放大和精细微调作用[6]。近年来国内外学者对周围神经受损引起的DRG离子通道的改变做了大量的研究,发现周围神经受损后,DRG上的离子通道被激活,通道的种类、数量、分布及膜电学参数等生理特征都发生改变,以致DRG神经元的兴奋性增加、放电频率增加和产生异位放电。此外,周围神经受损后,各种细胞因子的改变,对受损神经的恢复有着重要作用。

1.电损伤的相关研究

1.1 电损伤机体后病理生理机制:

电流对组织的损伤作用归纳起来有热效应,刺激效应和化学效应:热效应是以物理学焦耳定律电能转化为热能作为基础,热量的产生与电流强度,组织的电阻和接触时间成正比,电损伤时电流通过机体因传导径路上各组织的电阻不同,因而产生的热量亦不同,可造成不同程度的烧伤。部分的电流在皮肤组织转化为热能,使皮肤凝固碳化,皮肤凝固碳化后,电阻变小,继续进入机体的电流则进一步造成内部烧伤 另外,Raphael7等于1987年提出的电流通过组织时破坏了细胞膜脂质双分子结构,使细胞膜破裂和细胞溶解,组织受到损伤,真性电损伤作用。1989年,Lee RC89采用三维定量上肢电烧伤模型测量不同部位的电场强度及温度,用生物热方程式对照标准化的Hela细胞死亡的热耗公式,并通过数学模式计算后证实,在电烧伤中的确存在非热性损伤因素,并提出强电场对细胞膜有一种电穿孔作用(Electroporation)。即在强大电场作用下,由于细胞膜内外液和膜内外层面导电性悬殊,造成细胞膜的磷脂质双分子层通透性增大,细胞膜上产生许多小孔,导致细胞内大分子蛋白及DNA等漏出,细胞内游离钙离子增多,花生四烯酸代谢产物增多,最后造成肌肉组织和神经的渐进性坏死。在一定程度以内,这种电穿孔作用造成的裂孔尚可逆转而自然封闭,但超过一定程度后会导致细胞膜破裂,从而形成早发的和迟发的细胞损伤。这种经膜电势的产生和细胞的大小及其在电场中的排列方向有关,尤以大的长形的肌肉及神经细胞容易受到损伤。短时间触电引起的电击伤中,这种真性电损伤较明显,而长时间的触电,则以电产热造成的损伤为主,可掩盖细胞膜的电性破裂作用。

电损伤一般分为高压电损伤和低压电损伤。通常将1000V以下的称为低电压,1000V以上的称为高电压。电压是组织损伤的主要决定因素,其它如电流的种类、电流强度、组织电阻、电流径路、接触时间、个体敏感性等也起重要作用10。电压越高,通电时间越长,组织损伤越严重。高压电烧伤实质是一种类似挤压综合征的复合性损伤,在远离电流入口部位,虽然表面皮肤正常,但深部组织,尤其是血管,神经,肌肉遭到严重损伤。电流通过皮肤后,在体内总是沿阻力最小的通路运行,可迅速通过血管和神经。尤其是低压电流趋向于首先通过神经血管束,使神经和血管发生早期和延迟的组织缺血性坏死。在电流的出入口,由于截面积小,电流密度聚增,所以出入口的损伤往往又是十分严重,致使周围组织迅速陷入凝固性坏死。

电流分直流电和交流电两大类。同样500V以下电压,交流电比直流电危险性大3倍。除发生在实验室及某些特殊情况下,生活中发生的电损伤绝大部分为交流电引起。人体可耐受250mA直流电而不受损伤,但7080mA交流电通过心脏即可发生心脏室颤或可造成呼吸中枢麻痹、呼吸肌痉挛而致呼吸停止。不同频率交流电对人体的影响亦不同。目前工业用及民用的均为5060Hz的交流电,最易产生室颤等致命损伤。而电流频率增高则对人体的危害反而减小。当电流频率大于2Hz时损害作用明显减轻,某些高频电流甚至可用于治疗疾病10

1.2 神经电损伤的研究

神经电损伤的临床文献集中在资料总结上,从时间上看,分为急性和延迟性损害。周围神经急性损伤往往发生在损伤严重的肢体上,从以往的研究资料中很难做出评价。中枢神经系统损伤后,意识丧失发生率最高占67%。经治疗恢复者不会出现后遗症,但持续昏迷会导致死亡[11]。延迟性损伤包括灼痛、感觉过敏、肌肉无力、感觉麻痹等[12],对周围神经损伤的认识是1.低压电损伤是延迟性神经损害的主要原因;2.电流造成的永久性损害不会超出损伤范围;3.神经损伤由血管炎性反应、血栓形成、周围组织纤维化所致。4. 如果神经连续性存在,能恢复足够的保护性感觉。5. 正中神经易受损伤,依次是尺神经、桡神经、胫神经。 电损伤后发生的延迟性周围神经病的发生机制可能有电损伤致细胞膜破坏或电致微孔作用、血管炎症作用、神经营养血管血栓形成致神经组织局部缺血作用,及神经周围组织纤维化作用所致[7,9],电损伤致细胞DNA和酶的改变也是其原因之一[8]

基础研究比较分散,深度也不够,主要涉及形态学和电生理。形态学方面,早期急性研究发现大脑有斑点状出血,脊髓神经元染色质溶解,周围神经轴突破碎,髓鞘气球样变等。稍候对延迟性神经系统损害研究认为血管炎性反应、血栓形成、神经周围组织纤维化是其诱因[13]。电生理方面,电损伤后的神经主要表现为刺激阈值增高、动作电位幅度降低、传导速度下降。Abramov[14]1996)研究发现电流本身可以损伤神经纤维,粗纤维容易受到损害。近年来,研究人员对神经电损伤的电生理改变进行了进一步的研究,发现电流对神经轴膜及雪旺氏细胞有损伤作用[15]。王志刚[16]对兔坐骨神经电损伤后神经血流的变化研究发现,坐骨神经电损伤之后神经血流较实验前降低,且随着损伤电压的增大,神经血流明显降低;电损伤后神经血流变化与损伤后胶原沉积的多少具有相关性在分子水平方面,付国强[17]等报道了在电损伤兔坐骨神经实验中75伏电压尚不能损伤雪旺氏细胞的DNA合成能力和延迟整流型钾离子通道的活动,随着损伤电压幅度的增大,至125伏电压损伤时出现了雪旺氏细胞的DNA合成能力下降以及延迟整流型钾离子通道电流密度减小的变化,其机制可能和大分子蛋白受损有关,但缺少其他离子通道的研究。总之,神经电损伤比较常见,有待进一步的研究完善相关理论。

周围神经在受到电损伤后病理表现相关研究甚少。李学拥研究指出:50V电损伤神经后,2周时神经纤维出现空泡,雪旺细胞轴突复合体无明显变化,1月后神经恢复正常,雪旺细胞形态正常;75V电损伤神经后,2周时受损神经纤维数目增加,损伤程度严重,雪旺细胞形态无明显变化,1月时可见新生的神经纤维,其中新生的无髓神经纤维由雪旺细胞形成髓鞘逐渐包裹而成,3月时再生的神经纤维结构进一步成熟,可见新生髓鞘较薄,但外层光滑,也可见到尚未完全形成包裹的板层髓鞘;200V 电损伤神经后,1周时无髓神经纤维变性,雪旺细胞数目减少,有髓神经髓板全部松散,板层分离,1月时雪旺细胞基膜与轴突分离,髓鞘厚薄不均,髓鞘板层松散呈丝瓜束状,3月时,细胞结构消失。从其研究来看:一定幅度的电压损伤周围神经,随着时间的延长,神经会在溃变后可以逐渐发生修复恢复正常的结构和功能。并且适度的电压损伤周围神经,雪旺氏细胞仍存活并发挥作用[1819]

付国强等报道[17]了在电损伤兔坐骨神经实验中75伏电压尚不能损伤雪旺氏细胞延迟整流型钾离子通道的活动,随着损伤电压幅度的增大,至125伏电压损伤时出现了延迟整流型钾离子通道电流密度减小的变化,其机制可能和大分子蛋白受损有关。

在王志刚[16]的兔坐骨神经电损伤后神经血流的研究中发现50V组电刺激后对坐骨神经血流的增加程度较75V110V组显著,电损伤即刻血流较正常增加53.1%;随着电压的上升,血流的增加值也在减少,75V组及100V组电损伤即刻血流值较正常分别增加约37.4%25.3%,总结出电刺激对神经血流的增加作用存在一定的范围。实验中电损伤1周后3组的血流值均较损伤前下降,8周时50V75 V100V组下降分别约3.5%14.5%23.5%,发现电损伤后神经血流量的恢复是随着损伤电压的增大而延缓的。并提出电损伤导致的胶原纤维增生是神经血流减少的原因之一。

由此推断,和其他原因造成的损伤一样,作为在周围神经存在的具有神经修复作用的唯一细胞,雪旺氏细胞在神经电损伤后的再生修复的过程中也应增殖并发挥了修复受损神经的作用。

在高压电损伤周围神经方面朱维平等20观察了兔坐骨神经高压电损伤后的早期电生理改变;陈国华等21实验中发现高压电损伤中的途径电流可导致周围神经的病理改变。这些研究均充实了我们对周围神经电损伤机制方面的认识。

1.3离子通道在电损伤中的作用

电损伤情况下离子通道功能的改变尚无文献报道。离子通道作为大分子蛋白质在受到电流损伤时,这三种致伤因素势必都会引起其结构和功能的变化,并且随着电压增加电流的损伤机制逐渐加强。在其他学科研究中发现离子通道在神经损伤中具有双重作用,即一些类型离子通道的作用是对抗细胞损伤,而另一些类型离子通道的作用则是加重细胞损伤。例如电压敏感式离子通道在缺血时引起的离子流动可导致神经细胞损伤,这些离子流动即可直接引起损伤,又能导致谷氨酸的释放,间接导致损伤。最近的研究表明Na+K+ 通道数量和分布的改变均会导致神经功能的异常,随着时间的延长轴膜功能受到影响, 从而导致损伤轴突离子动态平衡的改变, 最终继发性轴突断裂[2223]

因此,结合离子通道的研究成果,通过研究电流对细胞膜上大分子蛋白的作用,尤其是离子通道在神经电损伤后的溃变和再生过程中的分布和结构的改变以及这些变化对神经功能改变的影响,可从分子水平反映神经的损伤程度。对于电损伤后离子通道的研究会进一步加深对神经电损伤机制的理解。

2  DRG离子通道在周围神经神经损伤后的研究现状

2.1周围神经切断

免疫组化和配体结合实验的方法证实,坐骨神经切断形成神经瘤后,在粗纤维去髓鞘处、神经出芽处及损伤神经封闭形成终末肿胀区终末球有大量的钠通道积聚[24]。进一步研究显示,感觉神经元特异的Nav 1.8在大鼠神经损伤区积聚[25],而在DRG胞体内含量减少,说明由胞体转移至了损伤区[26]以全细胞膜片钳方法证实,轴突切断后背根神经节大胞体神经元(发出Aβ纤维)总的K 电流降低,其中IA降低了60 Ik降低了50 ID无明显变化这说明了神经横断后表皮传入DRG神经元上钾电流的大量减少是由IK IA引起的,且与受损的初级传入神经元兴奋性变化有关[27]Abdulla等将变化扩展到背根神经节所有细胞,Ik在小、大、中型细胞都降低,与上述结果相似。另外IkCa也降低,以小细胞降低较多,中型次之,大型最少,但不是本身的降低,而是由Ca 2+电流降低所致。各型细胞钙通道电流的幅度与失活在有自切行为的动物中变化更为明显。这种行为的起因与大神经元钙通道电流的减少相一致。此发现支持了轴突自切假说,此假说可能与神经病理性疼痛相关,伴随着大的有髓感觉神经元性质的变化[28]Zhang的研究认为轴突横断提高了DGR无髓核轴突细胞的兴奋性[29]。在坐骨神经损伤但无切断的DRG神经元的研究中发现,周围神经(非中枢神经)的轴突横断导致了在CDRG神经元中功能性SNSNaN通道表达的减少,且支持了在周围神经损伤后可变性电生理性质的基础[30]Ishikawa等用免疫细胞化学证实,神经轴突损伤后Kv12Kv21的表达在背根神经节细胞明显降低,Kv11Kv13轻度降低,Kv14Kv16无明显改变。Kv12在大胞体神经元与Ik电流形成有关,上述神经损伤后Ik电流的降低与Kv12的表达降低有关;在脊神经结扎导致的慢性神经痛模型大鼠发现,Kv14在小胞体伤害性感觉神经元表达降低,并认为Kv14为决定C纤维兴奋性的主要成分,神经损伤后其降低引起IA减少,细胞兴奋性增高[31]

神经端侧吻合后,供神经干能够经侧枝发芽再生轴突[32]。吻合初期,供、受神经的背根节内生长相关蛋白一43(GAP-43)含量发生改变,反映了GAP43在供、受神经有不同的表达变化规律[33]。而轴突再生与细胞骨架系统的形成密不可分,生长锥的延伸必须有微管形成,才能算作成功的神经再生。轴突生长过程中,生长锥必须穿透周围环境的阻碍,同时生长锥后面的轴突必需保持稳定[34]。这种稳定性主要靠建造牢固的细胞骨架来获得,因为骨架系统,特别是微管系统可以防止微管蛋白多聚体发生解聚。若是在轴突的生长过程中,各种微管相关蛋白构建的细胞骨架间的协调被破坏,不仅使微管蛋白发生解聚.而且能切断聚合物阻止轴赛的延伸[3536]。神经再生后GAP-43作为生长锥内晟具活性的一类蛋白,它的增加和延续预示着神经组织正进行着的再生,而Tau的增加和延续。则表示细胞骨架紧随生长锥伸长以保证再生的成功[37]Tau蛋白是一种重要的微管相关蛋白,影响着微管的形成,而GAP-43是富含在生长锥中的神经生长相关蛋白。程飚[38]等通过免疫组化染色发现,TauGAP-43在吻合口部位和受神经内的表达具有一致性,即再生初期不表达或极少表达,主要表达发生在4周以后,表明轴芽的生长与骨架延伸是同步进行的;但是,无论是GAP-43,还是Taw蛋白,它们在神经纤维中的表达都晚于背根神经节内神经元细胞的表达12周。这说明神经损伤后,再生信号立刻被启动,神经元胞体开始合成神经再生所需的各类蛋白,然后由轴浆运输至再生部位,转运的过程正是纤维表达延迟的原因。
2.2
慢性压迫背根神经节及神经病理性疼痛

慢性压迫大鼠背根神经节(chronic compression of the dorsal root ganglion, CCD)后,大鼠出痛觉过敏、痛觉异常等。电生理研究发现CCD术后背根神经节细胞兴奋性升高,如自发放电增加、膜电位去极化和容易诱导放电等,但引起神经兴奋性改变的离子通道机制还在进一步的探索中。美国耶鲁大学医学院Robert HLaMotte教授等人在CCD方面做了大量的研究。Hang Yao[39]在对CCD术后激活的超极化阳离子电流的增量调节的研究显示:与对照组相比,CCD组无需改变其逆转电位、电压依赖性激活或者钝化的速率,即可明显增加了电流密度和激活速率。因为超极化阳离子电流的激活对神经元提供了去极化电流,因而加强了神经元的兴奋性,其结果与超极化阳离子电流促成CCD术后所致神经损伤的痛觉过敏假说相一致。慢性压迫对表皮传入神经元电压门控性Na+ K+电流的影响的研究中发现,在CCD中,Ka的减少,TTX-S Na+电流激活的超极化改变,以及对TTX-R Na+的增强作用可能促进了神经元的兴奋性,因而导致了疼痛和痛觉过敏[40]。国内晏妮等[41]通过采用胞内记录以及全细胞膜片钳记录方法,CCD术后发现在急性分离的体外细胞中仍继续存在细胞兴奋性升高,表现为对辣椒素敏感的背根神经节细胞产生动作电位的最小电流刺激强度,他们认为神经节压迫受损后,神经节细胞的瞬时外向钾电流(I A )降低可能参与介导了神经节细胞兴奋性的升高。在其它神经损伤模型中也发现了DRG神经元I A 降低,且与神经元兴奋性的升高有关[28,42]。在胃炎、膀胱炎症等模型中也发现,支配胃和膀胱的DRG神经元I A 降低,此现象与神经元兴奋性的升高相关[4344]。由此可见,不论周围炎症、部分或全部神经切断间接引起的DRG神经元损伤还是CCD模型直接压迫损伤神经元都能引起I A 降低,并参与神元兴奋性的升高。

神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthasenNOS)属于一氧化氮合酶(NOS)的一个亚型,主要存在于神经元中。大量的证据表明,伤害性刺激可引起初级传人末梢释放Glu,激活突触后膜NMDA受体,引起大量的Ca 内流入神经元,细胞内Ca 浓度升高,激活nNOS,生成NONO扩散至邻近的神经元或胶质细胞或作用于该神经元本身,诱导其产生胞内信号分子cGMP而参与神经损伤或炎症状态下的痛觉调制[45]NO在周围及中枢的不同水平的痛觉调制中起重要作用。在临床上,常见的和难治疗的痛是慢性痛。周围神经损伤后常引起慢性痛,机制至今不清。目前的研究表明,周围神经损伤后,背根神经节和脊髓后角I层发生的可塑性变化,如各类神经递质和各类受体的表达量的变化[46]、神经元表现型的变化、LTPLTD[47]等,可能是诱发慢性痛的直接原因之一。慢性痛的机制及其复杂,不能根据研究某种痛的机制来推断其他类型痛的机制。伤害性刺激可以引起脊髓后角nNOS的活化.产生NO;引起痛觉过敏;然而产生的NO又可以负反馈抑制nNOS的活性,阻止NO的过度生成,从而抑制痛觉过敏的产生。NO在脊髓水平主要参与痛觉过敏的形成和发展,其效应很可能是综合作用的结果[48] 。吴丽如等[49]通过研究发现大鼠桡神经钳夹伤后,脊髓nNOS免疫阳性结构发生可塑性变化,NO在桡神经钳夹伤后的痛觉调制中有一定的作用。

抗抑郁药广泛用于治疗抑郁,强制性障碍,以及神经病理性疼痛等疾病。其中,地昔帕明(desipramineDMI)为经典的三环类抗抑郁药,其作用机制为选择性地抑制去甲肾上腺素的摄取。同时,DMI对某些肿瘤、炎症等慢性疼痛具有较好的临床治疗效果[49] ,如短期加入DMI可减轻糖尿病人以及其他慢性神经病理性痛觉[50],且这种效应不依赖于抗抑郁作用[51],表明DMI存在多种作用机制。曾有报道,DMI对离子通道具有抑制作用,例如,DMI抑制乙酰胆碱激活的电流[52]。大量文献表明,三环类抗抑郁药具有镇痛效应。通常,低剂量三环类抗抑郁药显示镇痛效应。表明该效应不依赖其对单胺类神经递质重摄取的抑制。迄今为止,三环类抗抑郁药镇痛机制尚不十分清楚,其可能的机制之一是三环类抗抑郁药介导的脊髓背角突触处的递质重摄取抑制。此外,三环类抗抑郁药潜在的机制还包括阻断Na+ 通道,K+ 通道以及GABAβ受体[5357],其中,Na+ 通道是重要的参与镇痛效应的离子通道。三环类抗抑郁药对机体多种细胞Na 通道具有明显的作用。已有报道,DMI等三环类抗抑郁药可抑制大鼠肾上腺嗜咯细胞Na+ 电流[54]。在心肌细胞中,三环类抗抑郁药可频率依赖性地阻断其Na 通道,这种频率依赖的现象与局麻药作用于Na 通道相似[5556]DMI具有明显的抑制DRG神经元Na+通道作用,这可能是DMI等抗抑郁药参与治疗神经病理性痛觉的机制之一[57]

2.3 各种细胞因子、大分子蛋白与DRG神经元离子通道的关系研究

Schwab等研究发现成年哺乳类中枢神经损伤后再生困难很重要的原因是中枢神经系统的微环境不利于神经再生,存在着抑制轴突再生的分子[58] Brittis 2000年克隆鉴定的髓鞘相关的神经突起生长抑制分子Nogo是一个非常重要的再生抑制分子[59] 。随后Oentle发现它具有三种主要异构体,分别是Nogo-ANogo-BNogo-C,都会引起神经突起生长锥的崩解 [60]。其中以Nogo-A与神经再生的关系最为密切[59] 。它不但具有和Nogo受体作用的Nogo-66序列,而且具有额外的独特抑制区域[6162]。诸多研究证实Nogo-A广泛表达于中枢神经系统[63-67]。国内程希平等采用自行制备并已验证特异性的Nogo-A单克隆抗体[6869],利用免疫组织化学方法和免疫荧光双标记法详细地观察了Nogo-A在成年大鼠脊髓和背根节的分布,发现Nogo-A在成年大鼠脊髓,背根神经节和周围神经纤维的广泛存在提示其在正常状态下的神经功能中可能起重要作用[70]

降钙素基因相关肽(calcitonin gene—related peptideCGRP)广泛分布于中枢和周围神经系统,包括初级感觉神经元及其突起、脑干的运动性核团和脊髓前角运动神经元。在周围神经系统中CGRP具有传递伤害性感觉信息,参与痛觉信息传人的调制,促进Schwann细胞增殖,扩张神经组织血管,刺激乙酰胆碱受体的合成和积聚,参与神经肌接头的发育与塑形等重要作用;并在神经再生过程中可能发挥着重要的作用[71-73]。国内湘雅医学院对CGRP做了大量研究,发现坐骨神经压榨损伤后背根神经节(DRG)CGRP的表达上调[72],而坐骨神经结扎后DRGCGRP表达下调[74],应用外源性的神经营养因子可以上调背根神经节或猫动眼神经核内CGRP的表达[7576],脊神经后根切断后DRG和脊髓CGRP的表达变化呈现不定期的时空模式,可能参与了神经损伤后的再生过程[77]

神经系统损伤后的修复、再生是一个相当复杂的过程。近来研究表明,ATP受体在某些疾病发生的病理生理过程中扮演了重要的角色[78],如炎症、疼痛、缺血l生心肌病、卒中、睡眠障碍和帕金森病等。ATP受体在嘌呤类物质的代谢过程中充当媒介引发级联反应,导致恶性循环,致使疾病发生发展。坐骨神经损伤后,对应阶段的背根节神经元ATP受体作为代谢过程中的一种重要媒介,也会发生相应的改变[79]ATP通过与背根节神经元表面ATP受体结合,开放相应的离子通道,非选择性地引起阳离子内流,使细胞发生去极化反应,当膜电位达到阈值时产生动作电位[8081];拮抗剂Suramin可使细胞发生超极化反应而抑制动作电位的发放[82]。实验表明不同浓度ATP引起细胞去极化反应幅度不同,神经元去极化反应幅度与药物浓度成正相关[83]。黄华[84]等的研究发现坐骨神经损伤后背根节神经元兴奋性提高,ATP受体对ATP反应敏感性增强。

日本学者在选择性脊神经结扎模型中,发现未受损的DRG神经元中的脑源性神经营养因子有所增加[85]Lukyanetz等研究发现DRG神经元中神经钙蛋白与钙通道的共区域化,证实了神经钙蛋白的功能可直接与电压门控钙通道的活性相联系[86]。而J.-H. Zheng等通过对急性分离的DRG神经元研究,发现DRG神经元分离导致的高兴奋性是由对cAMP cGMP的增强的反应性所保持的[87]。在电压活化钙通道电流方面,发现辣椒辣素差别地调节鼠DRG神经元的电压活化钙通道电流[88]Busselberg等则发现大DRG细胞的电压门控钙通道电流被Al3+所阻滞,因此推测Al3+是一种对哺乳动物神经元的电压活化钙通道电流的有效的不可逆的阻滞剂[89]Carla等在实验中得出,5-羟色胺能对急性分离的鼠DRG神经元内超极化活化电流的调节,在不同的DRG神经元亚群内,5-HT可通过激活5-HT7 受体从而增加cAMP水平[90];他们在后来的实验还发现5HT通过配对的cAMP TTX-R钠通道增加了鼠DRG神经元的类伤害性感受器的兴奋性,5-HT能通过伤害感受器中的依赖性cAMP信号传导通路对TTX-R钠通道的调节,可能参与了痛觉过敏的产生[91]Cummins等研究证明了GDNF正向调节了无SNS鼠的持续性TTX-R电流,因此证明了正向调切的持续性TTX-R电流不是由SNS所产生的;因为TTX-R钠通道已经显示了在伤害感受的重要性,GDNF在轴突横断后DRG神经元的效果可能与这些细胞的伤害感受信号的传导调节有重要的关系[92]。对背根的损伤,与对周围神经或DRG胞体的损伤相比,在痛觉增敏的发展上有不同的效果。这些影响涉及到DRG膜兴奋性的不同变化,但都与依赖NMDA受体的通路(可能位于脊髓内)有关[93]。单核细胞趋化蛋白-1MCP-1)可抑制外向钾电流,引起钾电流显著差异的测试电压在一10 mV以上,Sun认为MCP-1通过以下两点加强了CCD神经元的兴奋性:1)对非电压依赖性去极化电流的激活,此激活方式类似于非选择性阳离子电导;2)对电压依赖性外向电流的抑制[94]。炎症介质通过增加DRG胞体的兴奋性,可能促成了CCD神经元的高兴奋性、痛觉过敏及触觉异常性疼痛[95]

神经急性损伤后相应神经元可发生逆行性溃变,由于损伤程度不同而引起坏死或凋亡。神经元的死亡与营养因子的丢失有关,轴突的损伤使得靶源性神经营养因子不能逆行输送,导致神经元缺失营养因子而死亡。其方式是神经元的凋亡[96]。有研究表明,坐骨神经的高位损伤可以诱导相应节段脊髓运动神经元的凋亡[97]。另有研究表明,神经损伤能诱导脊髓前角运动神经元重新表达神经生长因子受体,当神经再生到达肌肉时,神经营养因子受体的表达消失,其中神经生长因子低亲和力受体的表达可以诱导神经元的凋亡,尤其是该受体不能被足够的神经生长因子结合或用神经生长因子抗体将神经营养因子结合之后[98]。因此,当轴突损伤之后阻断了神经生长因子的逆行输送,导致高表达的神经营养因子低亲和力受体不能完全结合,从而诱发神经元的凋亡。神经元损伤后兴奋性氨基酸释放增加,导致Ca2+内流增加,激活了一氧化氮合酶(NOS),一氧化氮(NO)生成增加,弥散入周围神经元和胶质细胞,促使能量耗竭和DNA损伤,如损伤细胞不能修复,则导致细胞凋亡。

2.4 DRG神经元细胞钠钾离子通道研究现状

依据DRG中钠电流和动作电位的持续时间,钠通道可分为快、慢两种。根据对河豚毒素(tetrodotoxinTTX)的敏感性又可分为河豚毒素敏感性(tetr- odotoxin—sensitiveTTX—S)和河豚毒素不敏感性(tetrodotoxin— resistantTTX—R)钠通道。在大鼠发育早期,DRG小直径神经元主要表达TYX—R钠通道,随着发育成熟,该通道的表达有所减少,成年大鼠DRG小直径神经元中两种钠通道均有表达;而DRG大直径神经元主要表达TTX—S钠通道,并且随着大鼠的发育,呈现先减少后恢复的过程[99100]。钠通道是由一个α亚单位和(亚单位组成的跨膜糖蛋白。目前,已确定有9种基因编码的电压门控钠通道α亚单位,分别是NaV11NaV1.9 [101102] 4β亚单位,β1β23β4[103-106]。目前,对神经性疼痛DRG机制的研究主要集中在二种α亚单位:NaV1.3NaV1.8

在大鼠的神经性疼痛模型中,如慢性压缩性损伤(chronic constriction injuryCCI)和脊神经结扎(spinal nerve ligationSNL)后,可见成年大鼠DRG神经元上NaV13表达明显上调[107]。由于该通道可从失活状态快速恢复,不应期缩短,使神经元在高于正常频率的水平上去极化,故其介导的TTX—S电流受到明显调控。NaV13表达上调后,通道数目增加和电导增强,导致动作电位产生速度加快。加之DRG神经元中存在多种类型的钠通道,而钠通道本身又具有备用、失活和复活等多种状态,这些因素共同作用产生阈下电压振荡,引起DRG神经元的自发放电甚至高频放电,是神经损伤后发生神经性疼痛的基础。当切断大鼠坐骨神经,DRG神经元中NaV18基因表达出现持续210 d的下调,而电生理研究[108]也显示,TTX—R钠电流明显减弱,可持续60 d。免疫组化发现,该钠通道发生了重新分布,在DRG胞体内可有60 的下降,在损伤神经末端异常堆积。在坐骨神经横断模型中可以观察到神经损伤的同侧与对侧DRG神经元中β1亚单位mRNA表达没有区别,而β3亚单位在损伤同侧较对侧有明显上升[109],尤为明显的是,周围神经损伤后β3亚单位上调与NaV13的上调有一致性,约83 表达β3亚单位mRNA的神经元为NaV13,而约70 NaV13神经元表达B。亚单位mRNA [110],提示,β3亚单位参与了神经性疼痛的形成,与α亚单位,特别是NaV13共同调控DRG神经元的电活动。

钾离子通道广泛存在于神经元的胞体、轴突和树突的细胞膜上,钾离子通道对中枢神经元的兴奋性起主要的决定性作用。在脊髓后角神经元,如果细胞外液给予TEA(四乙基胺),钾离子通道的快速峰电位则被完全抑制[111],表明TEA敏感性钾离子通道动作电位产生过程与膜去极化有关。神经元的兴奋受门控性K 通道的控制,而K 通道的类型有许多种,不同类型的神经元可能有各自特异的离子通道的表达。目前,对于各种类型的K 通道在背根神经节和后角神经元的分布和作用所知甚少,Matus[112] 用原位杂交方法发现Kv15Kv16在脊髓前角运动神经元有高表达,在慢性吗啡吸入后,脊髓内神经元Kv15Kv16两种类型的钾离子通道的表达呈有意义的增加。王吉[113]等对大鼠背根神节内Kv2.1Kv4.2 mRNA的表达研究发现,背根神经节神经元含有较为丰富的Kv42通道,可能是其对保持神经元细胞膜内外K 浓度的差异有重要的作用。在正常状态下Kv42通道的开放,使神经元细胞膜主要对K 有通透性,并推论Kv42通道可能是产生和维持背根神经节神经元静息电位的形态学结构基础。

电压依赖性超级化激活的钾离子通道主要为内向整流型或称异常整流型钾通道,去极化激活的钾通道主要包括延时整流的钾离子通道和非延时整流的钾离子通道(“A” 电流) [114]。虽然有一些对哺乳动物中枢神经元钾离子通道的报道文献,但大多数观察的是大脑皮层、海马、下丘脑等神经细胞 [115-118]。对大鼠纹状体神经元研究表明,去极化可以激活一个电导为50pS的外向钾离子单通道[119]。国内兰同汉等运用膜片钳技术对急性分离的大鼠背根神经节神经元细胞上的电压依赖性钾离子通道进行了研究,分析了钾离子通道的特性,实验结果表明钾离子通道的电导为20pS,这与大脑皮层、下丘脑等神经细胞上所报道的电导50pS左右存在较大的差异,而与海马神经元的电导接近,后者为15pS20pS。由此可见,钾离子通道的“IA”电流和延迟整流型钾离子存在不同的蛋白质结构。[120]这对于进一步了解大鼠背根神经节神经元细胞电活动的机制,为临床治疗相关的神经疾病提供依据,具有一定的理论意义。

 


 

   

 

实验一 兔坐骨神经电损伤后DRG神经元细胞离子通道SCN9AKv1.5多克隆抗体的免疫组化观察

   

电压依赖性离子通道是神经元和其他可兴奋细胞赖以产生可传导电信号的结构基础,初级感觉神经元的超敏和异位放电是许多病理功能改变的基础,损伤神经元的异常电活动必然与电压依赖性离子通道的改变相关联。周围神经电损伤后表现感觉运动功能障碍较其他损伤明显,这与神经组织的特性有关。电损伤常发生于电流经过的组织,其中神经组织因电阻低,传导的电流密度大,在体内较易受到电流的破坏。神经电损伤时,电流经过损伤神经将引起膜上大分子蛋白的构像改变,但尚无这方面文献报道。本实验计划以蛋白水平的离子通道为切入点,通过免疫组化方法研究在周围神经电损伤后,相应背根神经节(DRG)上钠钾离子通道表达水平变化,通过研究电流对细胞膜上大分子蛋白的作用,尤其是离子通道在神经电损伤后的溃变和再生过程中的分布和结构的改变以及这些变化对神经功能改变的影响,可从蛋白水平反映神经的损伤程度。对于电损伤后离子通道的研究会进一步加深对神经电损伤机制的理解。

 

 

 

 

 

 

1实验材料

1.1主要实验仪器

显微外科器械            宁波显微外科仪器厂

动物手术台              自制

HLS-BX变频实验电源    上海浦江电表厂

小接触面电极            自制

外科显微镜              Moller-wepel

电子天平                Sartorius

纯水机                  ELGA

恒温烘箱                上海实验仪器厂

组织脱水机              徕卡TP1020

石蜡包埋机              徕卡EG1150

切片机                  徕卡RM2235

摊片机、烤片机          徕卡配套设备

1.2主要实验试剂:

主要试剂

(1).   0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS),稀释抗体和洗片子用;

(2).   清洁液、纯水,洗玻片用

(3).   多聚赖氨酸处理载玻片,防止脱片

(4).   固定液:4%多聚甲醛或冷丙酮等;

(5).   15%~30%蔗糖,组织脱水用;

(6).   梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋;

(7).   抗原修复液:柠檬酸缓冲液(pH6.0);

(8).   活化剂: Triton X-100

(9).   10%牛血清清蛋白(BSA)封闭液;

(10).             H2O2,灭活内源性过氧化物酶;

(11).             显色液: DAB显色试剂盒;

(12).             封片树胶。

免疫组化试剂 

(1).   大鼠抗兔钠离子通道多克隆抗体(SCN9A   上海英基生化公司

(2).   大鼠抗兔钾离子通道多克隆抗体(KV1.5   上海英基生化公司

(3).   HRP标记羊抗大鼠二抗免疫组化染色试剂盒   北京博奥森公司

(4).   DAB显色试剂盒                           武汉博士德公司

1.3 实验动物

兔龄约两月的中国本兔,雌雄不拘,体质量2kg-2.5kg,清洁级,由第四军医大学实验动物中心提供。

2实验方法

2.1 动物损伤模型的制备

2.1.1动物实验环境

动物实验于20078月至20086月在唐都医院烧伤整形科组织工程实验室完成,动物手术室紫外线消毒,平均气温20-26℃

2.1.2实验动物分组

分为两大组:立即处死取标本组和损伤后4周取标本组。其中,立即处死取标本组分为阴性对照组、50 V 损伤组、110V220 V 损伤组4 , 每组20只;电损伤后4周取标本组再分为110V220 V 损伤组,每组10只。

2.1.3实验装置及致伤参数

由上海浦江电表厂提供的变频实验电源,电压及电击时间均可控制,开关点触式,实验电压分别采用50V,110V,220V,其中110V220V是许多国家的民用电源.触电时间设置为3s。(见图1.1

2.1.4实验动物准备及致伤方式

2%戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉动物(1ml/kg),剪除臀部和下肢的毛发, 在下肢后侧正中线由腘窝至臀大肌剪开皮肤, 在腘窝处分离皮下组织寻找腘神经, 然后沿神经走行剪开肌肉充分暴露坐骨神经, 使其与周围组织分离, 在腘窝至骶骨区域内电损伤3 cm 神经(用不同电压值) ,立即组损伤后立即取材, 4周组缝合伤口按期取材。

1.1  变频实验电源电击现场  

1.2  暴露坐骨神经并连接电源导线。

2.1.5存活时间兔后肢的损伤情况:

    观察各致伤动物后肢的功能,及肢体远端的伤情等情况.

2.1.6取材

按损伤后即刻, 4w,2个不同时相点静脉麻醉兔子,剪去术区毛发,消毒铺单,按后背部正中切口,切开皮肤,皮下纤维结缔组织,然后钝性分离脊柱两旁棘突和横突,暴露腰椎L6—荐椎S1;用剪刀剪去棘突,然后用持针器作咬骨钳,咬去椎板,两侧的横突,持针器伸到椎板下方2mm,注意一点点小心钳下骨质,以免损伤脊髓;充分暴露脊髓后,牵起脊髓,可看到脊神经后根及其出椎管处,将其出椎管处的椎间孔咬开,可看到膨大的DRG附着在后根,大小约4 mm,呈浅黄色,椭圆形,表面光滑,用眼科剪剪下。

2.2脱水 采用全自动密闭式脱水机对组织进行脱水。

2.3包埋 将熔化的石蜡注入包埋托内(模具),而后用镊子将经过浸蜡的组织块从脱水盒中取出,放入包埋托中央,放在小冷台上,用镊子轻按组织块,以达到组织块平整,盖上脱水盒底,再加好石蜡,移至冷冻台上,待冷冻好后,卸下组织蜡块待切。包埋时应根据组织的不同,选择大小型号适合的包埋托;有要求直立包埋的组织要用镊子将组织固定在蜡块中央稍停片刻,以使组织在蜡凝时立住,达到立埋的要求。

2.4组织石蜡切片

2.4.1载玻片防脱处理

将玻片在洗衣粉水中浸泡过夜,用清水冲净后放入强酸中浸泡24h,取出用清水冲净。在70℃烤箱中烤干,置于无水乙醇中2h后取出,自然风干。将充分洗净并干燥的玻片浸泡在多聚赖氨酸稀释液中(110),5min后取出沥干,置于30℃烤箱中,烤干备用

2.4.2切片前的准备

清洗过的载物片(或免清洗的),毛笔,铅笔,小竹片,水槽,雾化器,摊片器,切片刀,刀架。
2.4.3
切片制作步骤

刀架的粗削部放在头端,在切片机刀架部夹紧。组织蜡块装在切片机蜡块固定器上夹紧。右手握切片机刀头运动手柄,左手转动切片机蜡块运动旋钮。先转动此钮,后平拉刀架运动手柄,进行粗削,直至组织切全。停止,将刀架移到细削部,轻轻转动蜡块运动旋钮,后拉刀架手柄进行细削。削至组织光滑发亮,右手拿毛笔扫净刀架及蜡块上的蜡屑,组织屑,放下毛笔,再用右手握住刀架运动手柄。左手拿小竹片,用竹片头蘸一下水槽中的水。左手中指搬动薄切钮,雾化器的喷头对准蜡块。右手拉刀架运动手柄。左手中的小竹片在蜡块空白处等待切片刀切起蜡片一端挑起粘住,随切片刀移动,完整的蜡片切出后,粘在竹片上,移入水槽中,捞片,放在摊片器上摊片5 min后,装在染色篮上,放入75℃烤箱烤片。

2.5 一抗的制备

2.5.1多肽的合成吉尔生化公司合成,纯度90%50mg.

由于在物种rabbits,钠离子通道和钾离子通道的蛋白序列不全,我们在钠离子通道中选取了NaV1.7 SCN9A(唯一一个拿到全长的),人和兔的SCN9A90%的相似,由于人的SCN9AC末端获得了免疫荧光的可靠证据!所以我们选取了SCN9A作为抗原。 在钾离子通道中,由于物种house mouse and rabbitsKV1.5中有83.2%的相似,而在物种rat KV1.5中已经获得免疫荧光的可靠数据!所以我们选择的片段是rabbitC端。

  为了提高抗体制备的成功率,我们采取融合蛋白的方式,即全基因合成C段对应的NR序列

多肽序列:KV1.5: CSLYALCLDTSRETDL

          NaV1.7 SCN9A: c-EYTSIRRSRIMGLSE

2.5.2多肽偶联:BSA1×PBS稀释到10mg/mg, MBSDMSO稀释到10mg/ml, 200ul BSA,加50ul MBS, 室温摇半个小时,然后装入透析袋,用1×PBS透析3,每次半个小时。吸出透析袋里的溶液装入5ml 的离心管, 多肽用1×PBS溶解至终浓度20mg/ml. 500ul 加入到上述5ml 离心管,摇2个小时,再把溶液装入到透析袋,用1×PBS透析3次,每次半个小时。最终用1×PBS调节至终浓度为3ml,并平均分成5管。

2.5.3免疫流程:第一次免疫:600ul+600ul弗氏完全佐剂,免疫。隔2周后,加强:300ul 1×PBS+600ul弗氏非完全佐剂,免疫;再隔三周按同样的方法加强3次。最后一次加强后过两周,放血,采用眼眶放血。

2.5.4 纯化:

(1) 多肽亲和柱的制备
1 布什漏斗用去离子dH2OSepharose,用小烧杯称取的6g潮湿packedSepharose,加18ml 2M Na2CO3,室温或者温度低需37温热;取2ml离心管,用350ul 乙氰溶解0.6g Cyanogen bromide,从37取出Sepharose,将溴化氰溶液滴加到旋摇的25C左右的Sepharose4B(不易过热过冷),室温继续旋摇2分钟。
2 预冷的布什漏斗和45ml BS,待激活的Sepharose刚抽干时,立即加入20ml BS洗,待又刚抽干时,加入剩下25ml60S完成(此时,加入丙酮处理,可以存放于-20C,稳定至少两个月),立即加入8ml的多肽溶液,立即将样品悬起来装入50ml的离心管,再加1ml蛋白溶液,洗一下,转移彻底,总体积12ml,盖紧盖子,放在冰上,摇床轻摇。过夜。

(2)亲和纯化

1 先用60ml 1×Glycine-HCl8ml/min,约2/秒;100ml 1×PBS8ml/min,约2/

2 4C取出过夜沉淀的血清,离心12000rpm×10min;血清过对照柱,8ml/min,约2/秒,反复2次,共30min

3 100ml 1×PBS,加入8ml 4M NaCl (1/15V )8ml/min(2/)。编号122ml收集管,每个加190ul1MTris碱。

4 50ml 1×GHE,流速2ml/min(约1/5秒)。每管总体积约1.9ml,共收集12管,使用200ul枪头测试头几管的pH值,标明第一管pH酸。

2.6免疫组化染色

2.6.1脱蜡

74℃恒温烤箱烤片30min,立即置于二甲苯中脱蜡3次,各5min;梯度酒精水化,分别为100%95%80%,各3min;自来水冲洗后,蒸馏水洗3次,各5minPBS3次,各3min至清亮。

2.6.2抗原修复与封闭

每张标本处滴加3%H2O2,置于湿盒内37℃孵育10min,灭活内源性过氧化物酶,蒸馏水洗三次,各3min;切片置于盛有0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)的微波修复盒中,置于微波炉中修复抗原5min,温度:95~100℃,取出容器,室温中冷却,10min后,用PBS冲洗3次,每次3min;每张标本滴加一滴10%BSA封闭液,封闭抗原以减少非特异性背景,置于湿盒内37℃孵育20min,不必洗片。

2.6.3滴加一抗

甩去多余液体,擦干玻片,每组切片分别滴加大鼠抗兔SCN9AKv1.5一抗,其工作浓度都为1100,置于湿盒中4℃孵育过夜,PBS洗三次,每次2min

2.6.4滴加二抗及显色

甩去多余液体,擦干玻片,每张切片分别滴加1滴生物素标记的二抗体,置湿盒内37℃孵育20minPBS洗三次,每次2min;每张切片1滴加滴辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(SABC复合物)工作液,置湿盒内37℃孵育20min;每张切片滴加1滴新鲜配置的DAB溶液,室温下镜控显色,自来水冲洗终止反应。

2.6.5复染

苏木素复染2min,自来水冲洗3min;盐酸乙醇分化30S饱和Na2HPO3pH8.5)返兰2min,自来水冲洗5min,梯度酒精脱水分别为80%95%100%100%,各3min;二甲苯透明(二甲苯1和二甲苯23min)中性树胶封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

2.6.6树胶封片

    切片自然晾干后中性树胶封片。

2.7判断标准及评分

钠离子通道SCN9A及钾离子通道KV1.5皆以细胞膜出现棕黄色颗粒沉淀物为阳性细胞。结果进行半定量积分判断:阳性细胞≤5%为0分,6%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,>75%为4分;阳性强度黄色为1分,棕黄色为2分,。将细胞阳性率与染色强度两者积分相乘:0分为阴性(-),14分为弱阳性(+),58分为阳性(++)。

2.8统计学方法

使用SPSS13.0软件,两组间比较采用两组等级资料MannWhitney U检验,所有结果以P<0.05为有统计学意义。

3结果

下图1.1PBS阴性对照,1.21.3中可见免疫组化染色的DRG神经元细胞,胞膜上有棕黄色颗粒沉着的为阳性细胞(箭头所指)。

1.1 DRG50V电损伤后PBS阴性对照染色     200×

1.2钠离子通道SCN9A110V电损伤后免疫组化染色     400×

 

1.3钾离子通道Kv1.5110V电损伤后免疫组化染色     400×

 

1  各电压组与阴性对照组的比较

80例立即处死的标本中,阴性对照组,50 V组,110 V组和220 V组钠通道SCN9A阳性表达率分别为100%100%70%10%;钾通道KV1.5阳性表达率分别为90%90%60%20%。对照组与50 V组相比较,无显著统计学差异;对照组与110 V组和220 V组比较,有统计学差异;110 V组与220 V组比较无统计学差异;钠钾通道对比无统计学差异(详见表1.1)。

电压强度

  

 

Na

K

Na

K

-

+

++

阳性率%

P

-

+

++

阳性率

%

P

对照组

0

6

14

100

U=-0.655

P=0.602

0

8

12

100

U=-0.251

P=0.841

U=-0.655

P=0.602

50 V

0

8

12

100

2

6

12

90

U=-0.251

P=0.841

110 V

6

12

2

70

U=-4.068

P=0.000

8

10

2

60

U=-2.964

P=0.005

U=-0.548

P=0.640

220 V

18

2

0

10

U=-5.664

P=0.000

16

4

0

25

U=-4.649

P=0.000

U=-0.874

P=0.602

1.1  80例立即处死标本各组NaK离子通道表达情况比较

 

2  电损伤4周后110 V组与220 V组比较

   20例电损伤4周标本中,110 V组和220 V组钠通道SCN9A阳性表达率分别为90%30%;钾通道KV1.5阳性表达率分别为90%50%110 V组阳性率高于220 V组,110 V组与220 V组比较有统计学意义,钠钾通道对比无统计学差异(详见表1.2)。

电压

  

Na

K

Na

K

-

+

++

阳性率

%

P

-

+

++

阳性率

%

P

110 V

1

3

6

90

U=-3.135

P=0.002

1

2

7

90

U=-2.653

P=0.011

U=-0.404

P=0.739

220 V

7

3

0

30

5

4

1

50

U=-1.009

P=0.393

1.2  电损伤4周后110 V组与220 VNaK离子通道表达情况比较

3 对照组分别与110 V4周组、220 V4周组比较

钠离子通道SCN9A110 V 4周组阳性率与对照组比较,U=0.695 P=0.588,无统计学差别;钾离子通道KV1.5110 V 4周组阳性率与对照组比较,U=0.313 P=0.812,无统计学差别;说明110 V组电损伤后4周恢复较好,钠钾通道对比无统计学差异P>0.05(详见表1.3)。  

时间

  

Na

K

Na

K

-

+

++

阳性率

%

P

-

+

++

阳性率

%

P

对照组

0

6

14

100

U=-0.695

P=0.588

0

8

12

100

U=-0.313

P=0.812

U=-0.655

P=0.602

4W

1

3

6

90

1

2

7

90

U=-0.404

P=0.739

1.3 对照组与电损伤后4110 V NaK离子通道表达情况比较

 

钠离子通道SCN9A220 V 4周组阳性率与对照组比较,U=0.438 P=0.000,有统计学差别;钾离子通道KV1.5220 V 4周组阳性率与对照组比较,U=0.338 P=0.001,有统计学差异,说明220 V组电损伤后4周恢复较差,钠钾通道对比无统计学差异P>0.05(详见表1.4)。

1.4对照组与电损伤后4220 V NaK离子通道表达情况比较

时间

  

Na

K

Na

K

-

+

++

阳性率

%

P

-

+

++

阳性率

%

P

对照组

0

6

14

100

U=-4.318

P=0.000

0

8

12

100

U=-0.338

P=0.001

U=-0.655

P=0.602

4W

7

3

0

30

5

4

1

90

U=-1.009

P=0.393

 

4.讨论

脊髓背根神经节(dorsal root ganglionDRG)是躯体初级感觉传入神经元的细胞体聚集处。钠钾离子通道广泛存在于神经元的胞体、轴突和树突的细胞膜上,是神经元和其它可兴奋细胞赖以产生可传导电信号的结构基础,在神经系统内控制着信号转导许多方面, 这些通道结构上细微的改变均会影响神经功能的正常。近年来对外周神经受损引起的DRG离子通道的改变做了大量的研究,发现外周神经受损后,DRG上的离子通道被激活,离子通道的种类、数量、分布及电生理特性都发生改变,以致DRG神经元的兴奋性增加、放电频率增加和产生异位放电。

钠通道是由一个α亚单位和(亚单位组成的跨膜糖蛋白。Nav1.7DRG中含量最丰富的钠通道蛋白之一,选择性高表达于脊髓背根神经节的感觉神经元上,产生快失活的TTX-S钠电流,参与伤害感受器动作电位的形成和传导。最新研究发现,编码电压门控Nav1.7通道的SCN9A基因突变可导致遗传个体无疼痛症。Nav1.7产生功能增强变异将导致严重疼痛相关的DRG神经元超兴奋,而失去Nav1.7导致不能感受疼痛。这一发现使SCN9A成为了疼痛学领域的新热点。

Kv通道在结构上与钠通道相似,其跨膜区也是由S1S6六个跨膜肽段及其问的连接形成。与K 通道相对应的钾电流一般可分为两类:一类是电压调控性钾电流,它们主要在动作电位的复极中起作用;另一类是内向性整流钾电流,它们主要维持细胞膜的静息电位的稳定。Kv1.5为延迟整流钾通道的一种亚型,膜去极化时经过延迟才激活,失活较缓慢,可被四乙胺阻断,与细胞膜的兴奋性密切相关。有研究表明Kv15Kv16在脊髓前角运动神经元有高表达,在慢性吗啡吸入后,脊髓内神经元Kv15kv16两种类型的钾离子通道的表达呈有意义的增加。有研究表明Kv1.5的减少,使延迟外向钾电流增大,使钾离子过度外流,导致细胞内低钾,进而促发凋亡。

电损伤是神经损伤的特殊形式,其特点是神经连续性存在可是神经内结构受损,电压不同对神经损伤的程度也不同。离子通道作为大分子蛋白质在受到电流损伤时,势必都会引起其结构和功能的变化,并且随着电压增加电流的损伤机制逐渐加强。因此本实验通过不同电压损伤兔坐骨神经后,考察DRG细胞SCN9AKv1.5的表达水平来了解不同电压损伤对DRG细胞离子通道的影响。

由于各种离子通道下降水平不一致,导致极化、去极化与复极化不同时期发挥作用的通道均发生变化,这可能导致正常和损伤神经元的不同放电模式。在其他学科研究中发现离子通道在神经损伤中具有双重作用,即一些类型离子通道的作用是对抗细胞损伤,而另一些类型离子通道的作用则是加重细胞损伤。例如电压敏感式离子通道在缺血时引起的离子流动可导致神经细胞损伤,这些离子流动即可直接引起损伤,又能导致谷氨酸的释放,间接导致损伤。

研究发现:周围神经在受到电损伤后病理表现也为细胞崩解,轴突变性,神经纤维肿胀变性和脱髓鞘改变等,同时发现:一定幅度的电压损伤周围神经,随着时间的延长,神经会在溃变后可以逐渐发生修复恢复正常的结构和功能。李学拥、付国强、王志刚等的研究认为电流的路径、类型、密度、电压强度、持续时间、接触范围、受损神经纤维的粗细等诸多因素决定了神经损伤的严重程度,而且作为重要神经修复细胞的雪旺细胞也受到了影响[161719]

本实验研究发现电损伤后离子通道表达水平发生了下降,且与电压成反比,电压越高下降越明显。50V组立即损伤与阴性对照比较无显著性差异(P > 0.05,其原因我们认为在于50V的损伤效应没有构成对通道蛋白结构的损伤,因此未造成它活性的改变。而110V基因的表达水平较低,与其他两组存在显著性差异(P < 0.05),说明加大电损伤幅度会使DRG细胞损伤加重,可能直接造成了大分子蛋白的损伤甚至蛋白结构改变,因此离子通道基因的表达影响程度加大。其中基因表达水平下降以220V电压组最显著,说明较高电压损伤神经较重,大分子蛋白受损伤加重使得离子通道功能受到较大影响,离子转运发生障碍,最终导致DRG细胞大量死亡,此时周围神经的电损伤将变为不可逆的。可见较低电压损伤对DRG细胞离子通道损伤较小,对离子通道基因的表达影响程度较轻,细胞活性水平较高;随着损伤电压的增大,细胞损伤加重,对离子通道基因的表达影响程度加大,故细胞活性水平降低,甚至细胞死亡。

本实验研究认为电损伤后伤后恢复与时间有相关性。4周时110V组基因表达水平较220V组较高,说明110V组神经恢复较好,显示较低电压的电损伤神经具有一定的恢复性,反观220V组与时间的长短无明显相关性,说明电压的大小是电损伤的愈后的重要因素,但缺乏远期的比较。本实验结果基本与以往发现符合,即电损伤一定幅度的电压损伤周围神经,随着时间的延长,神经会在溃变后可以逐渐发生修复,恢复正常的结构和功能。电损伤的恢复情况与具体的电压辐度和时间长短的关系需进一步实验研究。

本实验选取的两个离子通道SCN9AKv1.5在不同电压下表达水平比较均无显著性差异(P > 0.05),说明电损伤造成的损害对所选的离子通道之间无差别。离子通道的类型繁多,不同类型的神经元可能有各自特异的离子通道的表达,且各类型的离子通道所发挥的作用也不同,本实验所选的离子通道亚型有可能代表了大部分离子通道在电损伤时的情况,但不排除个别特异的亚通道在电损伤时表达水平会增加。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

实验二  兔坐骨神经电损伤后DRG内钠钾离子通道表达变化的RT-PCR方法观察

   

钾离子通道和钠离子通道广泛存在于神经元的胞体、轴突和树突的细胞膜上,共同参与神经元兴奋性的产生和传播、神经递质的释放、细胞增殖及细胞退化,对中枢神经元的兴奋性发挥决定性作用。当细胞受到刺激时,细胞膜上的电压门控性钠离子通道的内向电流是神经元动作电位产生和传导的基础;钾离子通道使动作电位复极化、维持细胞膜的静息电位以及决定神经元的放电频率。

电压依赖性钾离子通道和电压依赖性钠通道蛋白都由不同的糖基化亚单位组成,包括α亚基和β亚基;α亚基形成选择性离子通道,内孔,电压感受器和失活门控;β亚基参与调控通道表达水平,电压依赖性和动力机制。四个α亚单位结构相同,每个区域由6个跨膜片段(S1S6)组成,发夹环排成孔道,并且包括选择性过滤器。其中,钾通道的第14跨膜节段(S1-S4)与通道的门控性质相关。在钾通道的S4跨膜蛋白节段的分子序列中,每隔两个氨基酸之后就有一个带正电荷的氨基酸,构成电压感受器; S5S6之间的氨基酸链P环, 4α亚单位中的S5 P S6结构拼接在一起构成了离子通道孔,其中的S4S5链高度保守。

实验一是从蛋白的角度观察了兔坐骨神经电损伤后钠钾离子通道的表达变化,而实验二则是建立在DNA分子水平的实验,进而验证实验一的可靠性,也是尝试从另一角度阐明周围神经电损伤后离子通道的溃变及再生的规律。利用RT-PCR的方法研究DRG钠钾离子通道的电损伤后mRNA的表达变化,可从分子水平了解神经的损伤程度,进一步加深对神经电损伤机制的理解。

 

1 实验材料

1.1主要实验仪器:

净化工作台             苏州净化设备厂

高速离心机             湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司

凝胶成像仪             Bio-red公司(美国)

电热恒温水箱           上海福玛实验设备有限公司

圆筒式不锈钢过滤器     绍兴卫星医疗设备有限公司

基因扩增仪             杭州朗基科学仪器有限公司

恒压恒流电泳仪(DF-C)   北京君意东方仪器厂

1.2主要实验试剂:

DMEM培养基             GIBCO公司           

胰蛋白酶                GIBCO公司

胶原酶                  SIGMA公司

cDNA反转录试剂盒        Takara大连宝生物工程公司

RNA提取试剂(Trizol   Invitrogen公司 (美国)

引物                    上海生工生物工程公司合成

Pre-Taq                 Promega普洛麦格(北京)生物技术有限公司

PCRmarker               华美生物工程公司

琼脂糖凝胶              华美生物工程公司

1.3实验动物(同实验一)

1.4引物设计

利用Primer premier 5.0软件根据NCBIGenBank公布的钠钾离子通道序列,选取了Kv1.2, Kv1.4Kv1.5Kv11.1; Nav1.1βNav1.7α分别设计引物。扩增总的电压依赖性K+通道的引物设计在电压依赖性K+通道高度保留的S4S5链上。引物委托上海生工生物工程公司合成。

引物序列如下:

基因

accession number

引物序列

bp

Kv1.2

AF284420

F:5”CTACATCAAGGAGGAGGAACGG3”

269

603871

R:5”GGTCGGTGAAGGAGGTGGA3”

Kv1.4

AF493544

F: 5”TGTTCCTACACGGACCTGC3”

249

420—668

R:5”CCTCCCGATTGGTAATAATAAAG3”

Kv1.5

AF149787

F: 5”GTCTCCTTGGACGTGTTTGC3”

470

532—1001

R: 5”CAGGCAAAGAAACGCACAA3”

Kv11.1

AY706752

F: 5”CTGAAGGAGACGGAAGAGGG 3”

256

5—260

R5”CAGAGCCAGAGCCGAAGAT3”

Kv

————

F: 5”TTTCAAGTTGTCCAGACACTC-3”

230

 

R: 5”TGTCTCCATAGCCTACAGTTG-3”

Nav1.1β

(SCN1B)

NM_001082359

F: 5”CTATGAGAACGAGGTGCTGC3”

311

214—524

R: 5”_ACGAGCCAGATGGTCAAC_3”

Nav1.7α

(SCN9A )

NM_001082358

5”_GCTTTCTTAGCCTTGTTTCG_3”

192

10411232

5”_ATGTTTGCCTGGTTCTGTT_3”

Nav

————

5”_ATCGTCTGGCTGCTCTCGAATCTG_3”

381

R:TTAGATGGCATCACCCTCACTGTC

GAPDH

NM_001082253

F:5”CGGAGCCAAAAGGGTCATCAT3”

414

408—821

R:5”TTTCTCCAGGCGGCAGGTCAG3”

2 实验方法

2.1 动物实验环境(同实验1)

2.2 实验动物分组:

    中国本兔(第四军医大学实验动物中心提供)共25只,雌雄不拘,体重2-2.5Kg,随机分成5组,对照组,50V100V150V220V电击组各5只;采用电损伤仪进行损伤。电击坐骨神经,观察一周后,取背根神经节;提取RNA,以GAPDH作为内参,RT-PCR分析Kv1.2, Kv1.4Kv1.5Kv11.1; Nav1.1βNav1.7αmRNA表达量的变化。

2.3 实验装置及致伤参数(同实验1)

2.4 实验动物准备及致伤方式(同实验1)

2.5 取材(同实验1)

2.6 RT-PCR检测

2.6.1 Trizol一步法提取DRG细胞总RNA

       1)取背根神经节,剪碎,置于玻璃匀浆器中匀浆,采用注射器反复抽吸,将液体移入1.5 mlEP管中,加入预冷的Trizol提取液1ml,室温静置5分钟。

       2加氯仿0.2ml剧烈震荡15S,室温放置5分钟,然后离心(4℃12000rmp15分钟。

       3离心后液体呈3层,上层为无色水相层,中间相为白色,底层为红色有机相层,将上层水相小心转置于另一新1.5mlEP管中。

       4)加等体积异丙醇,混匀后-20℃1小时,离心(4℃12000rmp10分钟,弃上清。

       5)加冰预冷的75%乙醇1ml,离心(4℃7500rmp5分钟,弃上清,超净工作台开风机干燥约30分钟,见管底有白色沉淀,即为所得总RNA,将其溶于DEPC水中至20μl

6)提取的RNA1.2%琼脂糖凝胶电泳(如图1),鉴定RNA提取质量,紫外分光光度计鉴定纯度后即用于逆转录。

2.6.2 反转录:

以反转录试剂盒合成cDNA1μg RNA1μl oligo dT,加入DEPC水补至11μl 70℃ 5min4μl 5×逆转录缓冲液, 2μl 20 mM dNTP混合液,1μl RNA酶抑制剂,37℃ 5min1μl逆转录酶,42℃