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魏彦立学位论文

作者:
发布日:2010/4/21 8:47:16
  

 

 

 

兔坐骨神经实验性电损伤后雪旺氏细胞

生物学特性变化研究

 

 

 

研 究 生魏彦立

学科专业外科学(整形外科)

所在单位第四军医大学唐都医院整形烧伤科

    李学拥   

辅导教师李跃军  副教授

 

 

 

 

资助基金项目:国家自然科学基金30672180

        第四军医大学科技创新工程(CX02A014

关键词:坐骨神经;电损伤;雪旺氏细胞

 

中国人民解放军第四军医大学

20085



 

 

缩略语

英文全称

中文全称

SCs               Schwann cells                                       雪旺氏细胞

PNS              Peripheral nerve system                        周围神经系统

PN               Peripheral nerve                                 周围神经

KD                      Delay rectifier K+ channels             延迟整流型钾通道

KATP           ATP-sensitive potassium channel         ATP敏感钾通道

Kv                voltage-gated potassium channel         电压门控钾通

Kir                Inward rectifier K+  channels                           内向整流K+通道

HE               Hematoxyline-eosin                           苏木精-伊红

IHC             Immunohistochemistry                        免疫组织化

ECM           Extrocellunar Matrix                             细胞外基质

FBS              Fetal bovine serum                             胎牛血清

NGF            Nerve Growth Factor                         神经生长因子

BDNF          Brain Derived Neurotrophic Factor     脑源性神经营养因子

FGF              Fibroblast Growth Factor                    成纤维细胞生长因子

CNIF            Ciliary Neurotrophic Factor                  睫状神经营养因子

ECM           Extrocellunar Matrix                          细胞外基质

CAM            Cell Adhesion Molecules                      细胞粘附分子

TKs             Tyrosine kinases                               酪氨酸激酶

MIF              Macrophage migration                          巨噬细胞移动抑制因子

inhibitory Factor                                         

MCP-1         Monocyte Chemotactic                         单核细胞趋化蛋白-1

Protein-1

 

兔坐骨神经实验性电损伤后雪旺氏细胞生物学 特性变化研究

硕士研究生:魏彦立

      师:李学拥  教授

第四军医大学唐都医院整形烧伤科,西安,710038

 

中 文 摘 要

    背景: 近年来电损伤病人有增多的趋势,目前已占烧伤病人总数的8%,截肢率高达64.5%。在电损伤病例中周围神经是损伤修复与重建周期最长,恢复最困难的组织,周围神经电损伤后的修复成为现代电损伤研究的方向。电损伤后组织的病理改变是热能和电场共同作用的结果,常发生于电流经过的组织,其中神经组织因电阻低,传导的电流密度大,在体内较易受到电流的破坏。特点是神经纤维的连续性存在,但细胞膜因电致微孔作用而受损,给再生提供了较其它类型的神经损伤不同的先决条件。而雪旺细胞是周围神经的主要结构和功能细胞,在各种理化因素所致的周围神经损伤及随后的再生过程中,发挥着极为重要的作用。以往的研究主要集中于非电损伤情况下雪旺细胞的生物学特性变化,电损伤后,周围神经损伤区域内雪旺细胞在电流作用下其形态结构受损,生物学特性发生改变,但其具体微观形态结构和功能如何变化,改变后对周围神经再生有何影响,是否依然能起到支持神经再生的作用,目前相关研究资料较少。对神经电损伤后雪旺细胞的转归及功能状态的研究,有助于了解神经电损伤后周围神经的再生机制,揭示神经电损伤后神经病理变化机制,丰富电损伤和周围神经损伤理论,为更好的提高电损伤的治疗效果奠定实验基础。

实验一 兔坐骨神经实验性电损伤后雪旺氏细胞超微结构观察

目的: 研究兔坐骨神经电损伤后雪旺氏细胞超微结构变化。

方法: 随机将实验动物按损伤电压分为3组:55V组、110V组、220V组,按已建立的动物模型方法损伤兔坐骨神经,于伤后即刻、1w2w4w8w16w等不同时相点观察大体情况及其超微结构。

结果: 1)坐骨神经55V电损伤4w后,神经结构即恢复正常;(2)110V电损伤2w时,神经破坏加重,雪旺氏细胞增殖,16w时神经结构基本恢复正常;(3)220V电损伤时雪旺氏细胞被破坏,观察16w仍未见神经恢复。

结论: 兔坐骨神经在受到电损伤后雪旺氏细胞超微结构随损伤电压的增大而改变明显;电压在110V以下结构改变是可逆性的。

关键词:坐骨神经;电损伤;雪旺氏细胞;超微结构                                     

 

实验二 兔坐骨神经实验性电损伤后雪旺氏细胞周期及DNA含量分析

目的: 探讨兔坐骨神经实验性电损伤后雪旺氏细胞周期及DNA含量变化情况。

方法: 机将实验动物按损伤电压分为3组:55V组、110V组及正常对照组,对电击后不同时程兔坐骨神经进行取材消化细胞,进行流式细胞分析。

结果: 两组神经电损伤后雪旺氏细胞的DNA合成能力有抑制增加平稳的现象其中损伤后7天至14DNA合成能力最为显著;55V组及对照组之间比较无显著性差异(P > 0.05;而110VDNA合成能力水平较低,与其他两组有显著性差异(P < 0.05

结论: 电损伤后兔坐骨神经雪旺氏细胞DNA合成能力增加,随着损伤电压的增加,DNA合成能力降低;电损伤一周后随着时间的延长其合成能力水平呈下降趋势。

关键词:坐骨神经;电损伤;雪旺氏细胞;细胞周期;DNA


 

Impact of electrical injury on cytobiological feature of Schwann cell in the sciatic nerve of rabbits

 

Candidate for master: Wei Yanli

Supervisor: Li Xueyong

Department of Burn and Plastic surgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, China

 

Abstract

In recent years the incidence of patient damaged by electrical current has been increasing. Which has accounted for 8% of the burn patient, amputation rate reached as high as 64.5%. It is difficult to repair from the view of repair effect and treatment cycle that the peripheral nerve is damaged by electrical currents. So the peripheral nerve repair has become the trend research recently. 
Nervous electrical injury is caused by heat and electric energy. Electric injury often occurs in the tissues that the electric current passed through. Nervous fiber continuity was complete, but the cell membrane was demolished after electric injury. Schwann cell is the principal structure and functional cell of nervous tissue, it play a very important role in the regeneration of peripheral injured nerve.

Cytobiological feature of Schwann cell in physiological condition had been the hot research before. However the data about the biological changes of Schwann cell with electric injury is rare currently. What’s happened with the morphous and functions of Schwann cell and what the changes affect on the regeneration of peripheral nerve are unknown.

The research on the functions and changes of Schwann cell in injury nerve is advantaged to identify the regeneration and pathological mechanism of peripheral nerve. What we have done will provide the experimental theory basis for the therapy of electrical injury nerve.

The First Part: The observation of ultrastructure of Schwan cell in rabbit sciatic nerve with electric injury

Objective: To study the ultrastructure changes of Schwann cell in rabbit sciatic nerve with electric injury

Methods: The experimental animals were randomized into 3 groups according to the electrical voltage: the 55v group, the 110v group, and the 220v group. The model of the rabbit sciatic nerve with electrical injury was set up. The ultrastructure of the never injured was observed under the transmission electron microcopy in different time(0,1st week,2nd week,4th week,8th week,16th week).

Results: (1) In the 55V group, the morphological structure of nerve was recovery at 4th week. (2) In the 110V groupthe nerve injury was aggravated and the Schwann cell proliferated at 2nd week. The morphological structure of nerve was recovered at 16th week(3)In the 220 V groupthe Schwann cell was destroyed and the injured nerve was not recovered till 16th weeks.

Conclusion: The destruction of ultrastructure of nerve fibers is correlated positively to the force of the electrical current, higher the electrical current imposed, more serious the never injured. The ultrastructure destroy can be recovered with the electric current below 110 voltage. The recovery and regeneration of the Schwann cell are necessary to the nerve regeneration.

Key words: sciatic nerve; electric injury; Schwann cell; ultrastructure;

The Second Part: Expression of DNA in Schwann Cells of Rabbit Sciatic Nerve after Electrical Injured Experimentally

Objective: To observe the expression of DNA in Schwann cells of rabbit sciatic nerve after electrical injured experimentally, and study the influence of Schwann cells proliferation after injured by different voltage.

Methods: The experimental animals were randomized into 55v group, 110v group and control group. To separate Schwann cells from the injured region with trypsin and collagenase. The expression of DNA of Schwann cells in all groups were compared by reverse transcription polymerase chain reaction at different time points.     

Results: DNA of Schwann cells has been expressed in all groups and expressed more significant from 7 day to 14 day. There is no obvious difference between 55v electrical injury group and control groupP > 0.05.The expression of DNA of Schwann cell in 110v electrical injury group is low , which showed a significant difference in other groupsP < 0.05.

Conclusion: The expression of DNA in Schwann cells increased when nerve were injured by low voltage, and decreased with the adding of injured voltage. The expression of DNA decreased after 1 week from electrical injured.

Key words: sciatic nerve; electrical injury; Schwann cell


 

     

  

电损伤后,组织的病理改变是热能和电场共同作用的结果,近年来电损伤有增多的趋势,目前,已占烧伤病人总数的8%,截肢率高达64.5%。电损伤常发生于电流经过的组织,其中神经组织因电阻低,传导的电流密度大,在体内较易受到电流的破坏。电损伤后,神经纤维的连续性存在,但细胞膜因电致微孔作用而受损,给再生提供了较其它类型的神经损伤不同的先决条件。由于电烧损伤与普通烧伤在作用机理、病理变化、溃变再生过程等诸多方面都具有一定的特殊性,研究周围神经电损伤后的变化成为烧伤外科学的崭新领域。

雪旺氏细胞作为周围神经的支持与营养细胞在神经再生过程中发挥重要作用。电损伤时神经受损区域内整体在瞬间受损,包括轴突、髓鞘、雪旺氏细胞等,变性过程较快而全面,因而较其它类型神经损伤导致的雪旺氏细胞增殖也更多。付国强通过对电损伤兔坐骨神经的研究表明,通道尤其延迟整流型钾通道与细胞的增殖密切相关[1] 。王志刚的研究认为雪旺氏细胞Kv1.5mRNA的表达水平对表明雪旺氏细胞结构和功能和神经修复作用的发挥密切相关[2]

神经电损伤相关研究甚少,为丰富神经电损伤相关的病理生理机制的内容,我们设计了本实验,实验性电损伤兔坐骨神经后雪旺氏细胞生物学特性变化,是本实验观察研究的重点内容。


 

 

随着电能在人类的生产、生活上应用日益广泛,电流损伤人体的事故也日渐增多,全世界每年有许多人因触电致死或致残。流行病学调查可知,美国、加拿大的电损伤病人占同期收治烧伤病人总数的3-4%,国内电损伤约占住院烧伤病人的834;在急性电损伤病人中周围神经损伤的发生率高达29%5电损伤与普通烧伤在作用机理、病理变化、组织溃变再生过程等诸多方面不同,而目前对周围神经电损伤机理的研究等方面尚存在很大不足,因此有必要对其损伤机理及转归进行研究。

1 电损伤的相关研究

1.1 电损伤机体后病理生理机制:

电流对组织的损伤作用归纳起来有热效应,刺激效应和化学效应:热效应是以物理学焦耳定律电能转化为热能作为基础,热量的产生与电流强度,组织的电阻和接触时间成正比,电损伤时电流通过机体因传导径路上各组织的电阻不同,因而产生的热量亦不同,可造成不同程度的烧伤。部分的电流在皮肤组织转化为热能,使皮肤凝固碳化,皮肤凝固碳化后,电阻变小,继续进入机体的电流则进一步造成内部烧伤 另外,Raphael6等于1987年提出的电流通过组织时破坏了细胞膜脂质双分子结构,使细胞膜破裂和细胞溶解,组织受到损伤,真性电损伤作用。1989年,Lee RC78采用三维定量上肢电烧伤模型测量不同部位的电场强度及温度,用生物热方程式对照标准化的Hela细胞死亡的热耗公式,并通过数学模式计算后证实,在电烧伤中的确存在非热性损伤因素,并提出强电场对细胞膜有一种电穿孔作用(Electroporation)。即在强大电场作用下,由于细胞膜内外液和膜内外层面导电性悬殊,造成细胞膜的磷脂质双分子层通透性增大,细胞膜上产生许多小孔,导致细胞内大分子蛋白及DNA等漏出,细胞内游离钙离子增多,花生四烯酸代谢产物增多,最后造成肌肉组织和神经的渐进性坏死。在一定程度以内,这种电穿孔作用造成的裂孔尚可逆转而自然封闭,但超过一定程度后会导致细胞膜破裂,从而形成早发的和迟发的细胞损伤。这种经膜电势的产生和细胞的大小及其在电场中的排列方向有关,尤以大的长形的肌肉及神经细胞容易受到损伤。短时间触电引起的电击伤中,这种真性电损伤较明显,而长时间的触电,则以电产热造成的损伤为主,可掩盖细胞膜的电性破裂作用。

电损伤一般分为高压电损伤和低压电损伤。通常将1000V以下的称为低电压,1000V以上的称为高电压。电压是组织损伤的主要决定因素,其它如电流的种类、电流强度、组织电阻、电流径路、接触时间、个体敏感性等也起重要作用9。电压越高,通电时间越长,组织损伤越严重。高压电烧伤实质是一种类似挤压综合征的复合性损伤,在远离电流入口部位,虽然表面皮肤正常,但深部组织,尤其是血管,神经,肌肉遭到严重损伤。电流通过皮肤后,在体内总是沿阻力最小的通路运行,可迅速通过血管和神经。尤其是低压电流趋向于首先通过神经血管束,使神经和血管发生早期和延迟的组织缺血性坏死。在电流的出入口,由于截面积小,电流密度聚增,所以出入口的损伤往往又是十分严重,致使周围组织迅速陷入凝固性坏死。

电流分直流电和交流电两大类。同样500V以下电压,交流电比直流电危险性大3倍。除发生在实验室及某些特殊情况下,生活中发生的电损伤绝大部分为交流电引起。人体可耐受250mA直流电而不受损伤,但7080mA交流电通过心脏即可发生心脏室颤或可造成呼吸中枢麻痹、呼吸肌痉挛而致呼吸停止。不同频率交流电对人体的影响亦不同。目前工业用及民用的均为5060Hz的交流电,最易产生室颤等致命损伤。而电流频率增高则对人体的危害反而减小。当电流频率大于2Hz时损害作用明显减轻,某些高频电流甚至可用于治疗疾病9

1.2 神经电损伤的研究

神经电损伤的临床文献集中在资料总结上,从时间上看,分为急性和延迟性损害。周围神经急性损伤往往发生在损伤严重的肢体上,从以往的研究资料中很难做出评价。中枢神经系统损伤后,意识丧失发生率最高占67%。经治疗恢复者不会出现后遗症,但持续昏迷会导致死亡[10]。延迟性损伤包括灼痛、感觉过敏、肌肉无力、感觉麻痹等[11],对周围神经损伤的认识是1.低压电损伤是延迟性神经损害的主要原因;2.电流造成的永久性损害不会超出损伤范围;3.神经损伤由血管炎性反应、血栓形成、周围组织纤维化所致。4. 如果神经连续性存在,能恢复足够的保护性感觉。5. 正中神经易受损伤,依次是尺神经、桡神经、胫神经。 电烧伤后发生的延迟性周围神经病的发生机制可能有电损伤致细胞膜破坏或电致微孔作用、血管炎症作用、神经营养血管血栓形成致神经组织局部缺血作用,及神经周围组织纤维化作用所致[6,8],电损伤致细胞DNA和酶的改变也是其原因之一[7]

基础研究比较分散,深度也不够,主要涉及形态学和电生理。形态学方面,早期急性研究发现大脑有斑点状出血,脊髓神经元染色质溶解,周围神经轴突破碎,髓鞘气球样变等。稍候对延迟性神经系统损害研究认为血管炎性反应、血栓形成、神经周围组织纤维化是其诱因[12]。电生理方面,电损伤后的神经主要表现为刺激阈值增高、动作电位幅度降低、传导速度下降。Abramov[13]1996)研究发现电流本身可以损伤神经纤维,粗纤维容易受到损害。近年来,研究人员对神经电损伤的电生理改变进行了进一步的研究,发现电流对神经轴膜及雪旺氏细胞有损伤作用[14]。王志刚[2]对兔坐骨神经电损伤后神经血流的变化研究发现,坐骨神经电损伤之后神经血流较实验前降低,且随着损伤电压的增大,神经血流明显降低;电损伤后神经血流变化与损伤后胶原沉积的多少具有相关性在分子水平方面,付国强[1]等报道了在电损伤兔坐骨神经实验中75伏电压尚不能损伤雪旺氏细胞的DNA合成能力和延迟整流型钾离子通道的活动,随着损伤电压幅度的增大,至125伏电压损伤时出现了雪旺氏细胞的DNA合成能力下降以及延迟整流型钾离子通道电流密度减小的变化,其机制可能和大分子蛋白受损有关,但缺少其他离子通道的研究。总之,神经电损伤比较常见,有待进一步的研究完善相关理论。

周围神经在受到电损伤后病理表现相关研究甚少。李学拥研究指出:50V电损伤神经后,2周时神经纤维出现空泡,雪旺细胞轴突复合体无明显变化,1月后神经恢复正常,雪旺细胞形态正常;75V电损伤神经后,2周时受损神经纤维数目增加,损伤程度严重,雪旺细胞形态无明显变化,1月时可见新生的神经纤维,其中新生的无髓神经纤维由雪旺细胞形成髓鞘逐渐包裹而成,3月时再生的神经纤维结构进一步成熟,可见新生髓鞘较薄,但外层光滑,也可见到尚未完全形成包裹的板层髓鞘;200V 电损伤神经后,1周时无髓神经纤维变性,雪旺细胞数目减少,有髓神经髓板全部松散,板层分离,1月时雪旺细胞基膜与轴突分离,髓鞘厚薄不均,髓鞘板层松散呈丝瓜束状,3月时,细胞结构消失。从其研究来看:一定幅度的电压损伤周围神经,随着时间的延长,神经会在溃变后可以逐渐发生修复恢复正常的结构和功能。并且适度的电压损伤周围神经,雪旺氏细胞仍存活并发挥作用[1516]

付国强等报道[1]了在电损伤兔坐骨神经实验中75伏电压尚不能损伤雪旺氏细胞延迟整流型钾离子通道的活动,随着损伤电压幅度的增大,至125伏电压损伤时出现了延迟整流型钾离子通道电流密度减小的变化,其机制可能和大分子蛋白受损有关。

在王志刚[2]的兔坐骨神经电损伤后神经血流的研究中发现50V组电刺激后对坐骨神经血流的增加程度较75V110V组显著,电损伤即刻血流较正常增加53.1%;随着电压的上升,血流的增加值也在减少,75V组及100V组电损伤即刻血流值较正常分别增加约37.4%25.3%,总结出电刺激对神经血流的增加作用存在一定的范围。实验中电损伤1周后3组的血流值均较损伤前下降,8周时50V75 V100V组下降分别约3.5%14.5%23.5%,发现电损伤后神经血流量的恢复是随着损伤电压的增大而延缓的。并提出电损伤导致的胶原纤维增生是神经血流减少的原因之一。

由此推断,和其他原因造成的损伤一样,作为在周围神经存在的具有神经修复作用的唯一细胞,雪旺氏细胞在神经电损伤后的再生修复的过程中也应增殖并发挥了修复受损神经的作用。

在高压电损伤周围神经方面朱维平等17观察了兔坐骨神经高压电损伤后的早期电生理改变;陈国华等18实验中发现高压电损伤中的途径电流可导致周围神经的病理改变。这些研究均充实了我们对周围神经电损伤机制方面的认识。

在一病例中有人证实,周围神经再生和修复中表明轴突被有选择的电损害,包括未受损雪旺细胞在内的周围组织与其分开[19]

2 雪旺细胞在周围神经损伤后的研究现状

雪旺细胞(Schwann cellSC)是周围神经系统特有的胶质细胞,在周围神经发生、发育、形态和功能维持、损伤后再生等方面扮演着重要角色[20]。周围神经损伤后.雪旺细胞在一定条件的允许下可以部分或全部完成再生,部分恢复周围神经的功能。研究发现:周围神经损伤后的再生依赖于损伤侧的雪旺细胞所提供的神经营养因子,神经营养因子通过轴突的逆行转运而支持神经细胞的存活,同时Dezawa-M指出神经再生不是轴突在雪旺细胞膜下伸展的一种简单现象,而是以轴突和雪旺细胞直接和动态的信息传递为基础,揭示了雪旺细胞在周围神经损伤后支持再生的部分变化机制[21]

2.1 周围神经溃变再生过程中雪旺氏细胞和巨噬细胞的相互作用

周围神经损伤后,远端发生Waller变性,轴索和髓鞘完全崩解,惟有雪旺细胞分裂增殖,形成bungner ,引导再生轴突生长[22]研究发现,引起SCs增殖并进行正常的瓦勒氏变性的是巨噬细胞,而不是神经溃变物 [23-24] 周围神经溃变再生过程中巨噬细胞的来源,主要存在两种看法:一种认为由循环血液中的单核细胞演变而来,另一种认为由组织巨噬细胞活化而来。现有研究大多支持血源性单核细胞转化为巨噬细胞后吞噬髓鞘片断25-28。大多数髓鞘变性后的清除由巨噬细胞和雪旺氏细胞完成,但SCs吞噬能力较弱,主要由巨噬细胞吞噬,它们在神经受到损伤后两天就从血管进入变性的神经纤维中吞噬溃变的髓鞘及轴突碎片29-32

瓦勒氏变性时巨噬细胞的趋化聚集对于雪旺氏细胞在神经变性以后的增殖过程中发挥着极为重要的作用:Perry31观察到SCs恰好在巨噬细胞趋化聚集时大量增殖;Beuche 32实验证明周围神经溃变后,如果缺乏巨噬细胞存在,SCs不发生分裂增殖;Baichwal33发现巨噬细胞吞噬髓鞘时可产生一种条件培养液,这种培养液对于SCs的分裂具有促进作用;国内龚炎培等34实验证明将巨噬细胞、SCs联合培养后,SCs分泌的NGFmRNA含量明显增加,且在3天内持续上升。Kubota[35]通过向小鼠腹腔内注射硅尘粒悬浊液拮抗其体内巨噬细胞功能后,观察坐骨神经损伤后远侧端增殖状况时发现:损伤后1-2天内注射组SCs明显少于未注射的对照组;第3天时两组的SCs数基本相同;到第7天时未注射组的SCs数相对高于注射组。由此得出了巨噬细胞在促进SCs增殖过程,特别是增殖的起始阶段发挥重要作用的结论。以上研究充分证明了巨噬细胞可以引起周围神经受损区域SCs有丝分裂,产生大量的、完全分化的SCs。然而对于巨噬细胞刺激SCs增殖的详细机制,目前仍然知之甚少。

研究发现巨噬细胞游动抑制因子﹙macrophage migration-- inhibitory factorMIF﹚在周围神经损伤后巨噬细胞的募集过程中发挥着重要作用。MIF最早是在研究迟发型超敏反应中被发现的,因其能抑制巨噬细胞在炎症局部游走并激活该细胞而得名[36]。以后发现MIF具有多种生物活性,如激活巨噬细胞的粘附能力、增强其吞噬功能和杀肿瘤的活性等。并可激活巨噬细胞分泌细胞因子[37]。有学者观察大鼠周围神经损伤后MIF的变化时发现:在大鼠坐骨神经横断伤后MIF的表达,SCs是其主要来源;在损伤后12小时内,MIF的表达维持在较低水平,24小时后骤然上升至高水平,并在一周内维持在较高水平,之后回落至正常水平。而且他们发现MIF表达的升高与神经损伤后巨噬细胞在损伤处的募集时间相一致,在神经损伤后一般在23天后才会出现大量巨噬细胞的浸润,这可能和神经损伤后MIF表达的相对延迟升高有关[38 39]。黄涛等[40]通过观察SD乳鼠损伤的坐骨神经,发现损伤的周围神经能激活和促进雪旺氏细胞分泌MIF,在激活巨噬细胞、调节免疫炎症反应过程中可能起重要作用。

在周围神经瓦勒氏变性过程中,巨噬细胞将发生定向趋化游走,趋化物以前认为是瓦勒氏变性时髓鞘崩解的产物,但近来研究发现巨噬细胞迁移的信号与髓鞘崩解的数量无相关关系,在髓鞘崩解之前,SCs的代谢物已经促进了巨噬细胞的迁移,且SCs的代谢物质脂质成分的mRNA水平与巨噬细胞的吞噬作用呈正相关[41],因而推测SCs的代谢物质脂质成分是引起巨噬细胞趋化的物质。 也有学者发现在周围神经瓦勒氏变性过程中某些血清补体也可能参与了巨噬细胞的定向游走和吞噬过程[42] Carroll[43]用反转录PCR及原位杂交的方法研究发现:周围神经损伤后1.5小时,在损伤区域的一细胞亚群中即可检测到单核细胞趋化蛋白-1monocyte chemotactic protein-1,MCP-1﹚的mRNA表达,16小时后在损伤处及整个远侧端神经内膜细胞亚群中开始出现MCP-1蛋白表达。其中MCP-1mRNA在神经损伤后一天达到高峰,至伤后18天均有表达,MCP-1蛋白的出现稍早于巨噬细胞的聚集,整个时程与其一致。他们还发现周围神经损伤后Waller变性延迟且不出现巨噬细胞聚集的C57BL/W1ds﹚种族小鼠,在其神经损伤后检测不到MCP-1 mRNA的表达。Toews[44]等用类似的方法进一步发现表达MCP-1 mRNA的细胞主要为雪旺氏细胞。也有学者发现神经胶质细胞产生的白血病抑制因子﹙Leukaemia inhibitory factor LIF﹚可诱导巨噬细胞聚集[45]

从以上文献报道可以看出:就目前的研究而言,导致周围神经损伤后巨噬细胞定向聚集和迁移的趋化物大多与SCs有关, SCs产生的趋化物或趋化因子是巨噬细胞定向迁移和聚集的主要原因。

周围神经损伤后雪旺氏细胞和巨噬细胞有一个相互促进、相互作用的过程:神经受损导致SCs周围微环境发生改变,使其产生某些细胞因子,对巨噬细胞产生趋化和聚集作用,并可促使聚集的巨噬细胞分泌细胞因子,这些细胞因子又会促进SCs的增殖。两者的作用是相互的、多重的,共同促进周围神经的修复再生。

2.2 神经损伤后雪旺细胞形态变化及存活增殖情况

雪旺细胞在神经损伤后24 h开始增殖,损伤后3 d明显增加,损伤后7 d达高峰, 24周后增殖停止[46]。而赵富强[47]研究发现,周围神经损伤后远端神经内雪旺细胞在48小时以后开始增生,在1周左右达到高峰,增加6-8倍,以非成髓鞘雪旺细胞为主。Sulaiman[48]发现4周以上的失神经支配会引起雪旺细胞形成髓鞘能力的下降,但只要与新生轴突及时接触,萎缩的雪旺细胞能够重新回到形成髓鞘的表型,形成髓鞘。在形态变化上,有研究发现损伤后1个月时,损伤远端神经中已无轴突及髓鞘结构,雪旺细胞核不规则,溶酶体和线粒体丰富、粗面内质网扩张,横切面上,雪旺细胞周边有许多由单位膜包裹的无髓神经纤维样结构,其内也有许多线粒体等细胞器,外有完整基底膜,切面上发现雪旺细胞两端有指状突起伸出,随着损伤时间的延长,单位面积内雪旺细胞数量逐渐减少,神经内膜下和神经内膜间胶原原纤维逐渐增多[49]。在神经损伤后雪旺细胞存活时间上,以往的研究认为损伤远端的雪旺细胞呈进行性萎缩,并在损伤后1年逐渐被结缔组织所替代[50],但Dedkov[51]观察到神经损伤后25个月,失去轴突接触的神经干内依旧有雪旺细胞残存,并且这种细胞能表达S-100N-CAM等因子。姚健[49]等的研究表明,神经损伤后1个月,损伤远端神经中p75NTRS-100的表达最多,在损伤后6个月时,p75NTR降至正常水平,S-100则在损伤后9个月是消失。

2.3 神经损伤后雪旺细胞神经营养因子的表达

伴随着神经损伤后雪旺细胞发育、增殖,雪旺细胞不仅为轴突再生提供机器性引导,而且为神经突起生长提供有吸引力的活性表面,表现为雪旺细胞的多种生物活性功能,即可合成分泌多种神经因子:如神经生长因子(NGF),脑源性神经营养因子(BDNF),睫状神经营养因子(CNTF,神经营养素-345(NT-345)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、成纤维细胞生长因子(FGF),低亲和性神经生长因子受体(p75NGFR),细胞表面粘附分子(CAM)和细胞外基质分子(ECM)[52]。目前,这些神经因子在雪旺细胞促进周围神经再生方面发挥着重要的作用。NGFBDNF为神经营养因子家庭的成员,对维持神经元的存活、生长、分化以及损伤后的修复与再生具有重要的作用[53]

2.3.1  NGF  是一种细胞生长调节因子,它对中枢和周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均有重要的调控作用。正常情况下,雪旺细胞能产生NGF,其表面存在NGF受体,正常神经纤维的NGF水平并不高,当神经受损伤后,雪旺细胞大量分泌NGF Rolf[54]运用原位杂交实验在对大鼠坐骨神经的交感神经、感觉神经的损伤远端、损伤近端及靠近神经元三个不同节段的mRNANGFNGF的测定,证明雪旺细胞在损伤后反射性地大量分泌NGF起到一个替代靶器官提供NGF的作用。NGF细胞效应通过细胞表面二类截然不同的受体介导。Trk受体家族和NGF家族成员呈相对特异高亲和结合。TrkANGF结合,TrkBBDNFNT45结合,TrkC仅和NT3结合。NGF另外一个受体为P75NTR受体和NGF家族成员呈低亲和结合。Megumi[55]运用免疫细胞化学及单克抗体技术在大鼠坐骨神经切断法中发现:NGF受体定位于雪旺细胞表面并构成分泌Bungner带;坐骨神经再生轴突远点雪旺氏细胞在时间和空间上伴有NGF受体(NGF)的增加;雪旺细胞NGF受体的诱导表达也可以在运动和副交感神经上出现;轴突和雪旺细胞的接触可以逆转雪旺细胞NGF受体(NGF)的表达。这些NGF可以通过再生轴突圆锥的胞吞作用逆行转运到胞体,维持神经元的存活,调节轴突圆锥的芽生、延伸及趋化。神经损伤后,NGF靶神经元的NGF受体表达水平增加,同时靶区NGF水平也明显升高[56],提示NGF能促进效应神经元轴突损伤的修复。应用外源性NGF,能显著增加再生神经纤维数量、轴突直径及髓鞘厚度,促进再生神经纤维的成熟,使神经纤维再生速度加快,且能维持轴突损伤后脊髓前角运动神经元及脊神经节感觉神经元胞体的存活。探讨NGF促进周围神经再生机制为神经元的营养效应;促进和诱导神经突起生长[57]

2.3.2  BDNF  脑源性神经生长因子(BDNF)及神经营养素(NT-3)同属于NGF基因家族,BDNF对在体运动神经元的发育、成年后运动神经元的存活以及病变运动神经元的存活和轴突再生起着十分重要的作用[58]。正常的坐骨神经中,BDNF mRNA水平相当低,但神经损伤后,BDNF mRNA水平明显增加,并且其受体p75NGFR mRNAtrkB mRNA水平也随之上升,以上三种mRNA均存在于雪旺细胞中,发挥促进轴突再生的作用[59]。在周围神经再生和髓鞘形成中,幼稚雪旺细胞表达的p75(NTR)在支持轴突和再生中发挥重要的作用,p75(NTR)这种低亲和力受体适合所有神经营养因子家族成员,最终应答依赖于胞内神经酰胺的水平,而且雪旺细胞由改变其表达水平调整应答,这种效应对神经营养因子有选择性[60] 内源性BDNF对周围神经再生和髓化的机制还不十分清楚,Fernandes发现BDNF对周围神经再生的影响可能依赖受损神经元的高亲和力受体TrkB[61],但Cosgaya认为P75NTR是促进髓鞘形成的功能性受体,而非TrkB介导BDNF促髓鞘形成[62]

3 雪旺细胞促进基底膜、髓鞘形成的作用

    基底膜的主要成分包括层粘连蛋白(laminin,LN)、纤维粘连蛋白(fibroneetin,FN)、IV型胶原(collagen, IV)、硫酸肝素蛋白糖(HSPG)、内皮粘连蛋白(entactin)、乙酰胆碱脂酶、V型胶原等。雪旺细胞可分泌上述多种基底膜成分,其中LN位于雪旺细胞基底膜管的内表面,能够诱导再生轴索的生长,再生轴索就是沿着管的全长贴附在基底膜的内表面生长,雪旺细胞分泌的β-聚糖和α2-层粘连蛋白链具有减少雪旺细胞在轴突变性是的损失和在轴突再生期渐进增加髓鞘再生的作用[62]。雪旺细胞可合成2HSPG,一种参与构成雪旺细胞膜,作为膜蛋白黏附在雪旺细胞的细胞骨架上;另一种参与构成基底膜,它的主要作用是促进雪旺细胞的分裂增殖,它与LN的相互作用对LN依赖性雪旺细胞的伸展也起重要作用,雪旺细胞在基底膜存在的情况下形成髓鞘并逐渐成熟。雪旺细胞与基底膜各种成分之间,再生轴索之间是相互作用、相互影响的,正是这种关系影响着神经的再生。

周围神经纤维表面的髓鞘来源于雪旺细胞的表面膜,其形成过程甚为复杂,是在轴突周转的大分子成分自我组配的一个动态过程。诱导雪旺细胞髓鞘化也需要轴突表面信号的表达,在轴突对雪旺细胞表型的调节中,细胞内的cAMP水平升高,促发雪旺细胞分裂,还可以明显增加雪旺细胞中PDGFFGF受体基因的表达,并且可诱导髓周围蛋白(P0)和髓磷脂碱性蛋白(MBP)基因的表达,P0MBP在周围神经成髓鞘过程中起着重要作用[63]                                 

4 流式细胞周期(FCM)DNA倍体分析的基本原理

在生物细胞核中,DNA含量并非恒定,随细胞增殖周期时相不同而发生变化。G0期是第一次细胞分裂完成后进入第二次分裂开始前的阶段。换言之,即第一次细胞分裂完了形成两个子细胞,在未接受另一次分裂信号之前,即为G0期。G0期细胞是不参与细胞增殖的一群细胞,即为静止细胞,其DNA含量为较恒定的2C,即二倍体(diploid)。G1期指的是第二次分裂开始到本次DNA复制之前的过程,此期主要功能是积累能量核原料为DNA的复制做准备,故又称DNA合成前期。G1期细胞具有增殖活性,开始有RNA的合成;G0期和G1期是细胞处于周期过程中两种不同功能状态时相的细胞,不能视为同一细胞,但就DNA含量而言,两者相同,均为二倍体DNA含量。S期,又称DNA合成期,合成及复制DNA。当细胞进入S期后,DNA含量值逐渐从2C---4C增加,直到细胞DNA倍增结束,进入G2期。G2期指从DNA复制完成到有丝分裂开始的时间区间,又称DNA合成后期或有丝分裂前期,此期合成大量蛋白质,为M期的细胞分裂做准备。经过G2期后,细胞最终进入M期,M期即有丝分裂期,细胞进行分裂,M期时间间隔是指从有丝分裂开始到结束,M期又分为前、中、后、末四期。在M期分裂为两个子细胞之前,G2期和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C,即四倍体细胞群。

FCM分析细胞周期与DNA倍体时,需对DNA进行染色。荧光染料(如PI)与细胞DNA分子特异性结合,而且有一定的量效关系,即DNA含量的多少与PI结合量成正比,荧光强度与荧光直方图的通道数成正比。因此,FCM分析一个群体细胞峰细胞周期与DNA倍体时,将DNA 含量直方图分为三部分,即G0/GISG2/M期三个细胞峰。G0/G1G2/M细胞峰DNA的含量呈正态分布,S期细胞峰则是一个加宽的正态分布。(见图表1

 

 

      

图表1  细胞周期与DNA含量变化及其FCM分析直方图


 

   

实验一  兔坐骨神经实验性电损伤后雪旺氏细胞      超微结构观察

   

    周围神经电损伤后表现感觉运动功能障碍较其他损伤明显,这与神经组织的特性有关。电损伤常发生于电流经过的组织,其中神经组织因电阻低,传导的电流密度大,在体内较易受到电流的破坏。电损伤后,神经纤维的连续性存在,但细胞膜因“电致微孔”作用而受损,致使其再生比其它神经损伤出现必然的困难性。而雪旺细胞是周围神经的主要结构和功能细胞,在各种理化因素所致的周围神经损伤及随后的再生过程中,发挥着极为重要的作用。对神经低压民用电损伤后雪旺细胞的超微结构观察,有助于了解神经电损伤后周围神经的再生机制,揭示神经电损伤后神经病理变化机制,丰富电损伤和周围神经损伤理论,为更好的提高电损伤的治疗效果奠定实验基础。

 


 

实 验 材 料

1 主要实验仪器:

倒置显微镜              Nikon

外科显微镜              Moller-wepel

显微外科器械            自购

HLS-BX变频实验电源    上海浦江电表厂

小接触面电极            自制

净化工作台              苏州净化设备厂

CO2细胞培养箱                    德国Heraeus公司

离心机                  赛特湘仪离心机仪器有限公司

电子天平                Sartorius

透射电子显微镜          第四军医大学电镜中心

2 主要实验试剂:

胎牛血清﹙FCS                 民海生物公司

胰蛋白酶                             GIBCO公司

型胶原酶                         GIBCO公司

丙酮                               西安化学试剂厂

  主要试剂配制:

1.0.25%胰酶                       2.5g胰蛋白酶溶于1000mlD-Hanks平衡盐溶液   中,过滤除菌,4保存。

    2.0.2%胶原酶                      0.125g胶原酶溶于100mlD-Hanks平衡盐溶

液中,过滤除菌,4保存。

    3.PBS                                  137mmol/L NaCl,2.7 mmol/LKCl,

4.3 mmol/L NaH2PO41.4 mmol/L KH2PO4,调节PH值到7.4

    4.20DMEM培养液          按产品说明配制,加入青霉素100u/mL,加入链霉素100u/mL,按最终体积的20%加入小牛血清,过滤除菌,4保存。

3 实验动物

兔龄约两月中国本兔,雌雄不拘,体质量2kg-2.5kg,清洁级,由第四军医大学实验动物中心提供[许可证号SCXK() 2002-2005]。

 


 

实 验 方 法

1 动物实验环境

动物实验于20068月至20076月在唐都医院烧伤整形科组织工程实验室完成,动物手术室紫外线消毒,平均气温20-26

2 实验动物分组

    中国本兔(第四军医大学实验动物中心提供)共72只,雌雄不拘,体重2-2.5Kg,随机按损伤电压大小分为55V损伤组、110V损伤组、220V损伤组3,采用电损伤仪进行损伤。每组按观察期限再分为电损伤即刻、1w2w4w8 w16w6个小组, 每小组4只动物

3 实验装置及致伤参数

由上海浦江电表厂提供的变频实验电源,电压及电击时间均可控制,开关点触式,实验电压分别采用55V,110V,220V,其中110V220V是许多国家的民用电源.触电时间设置为3s。(见图1.1

4 实验动物准备及致伤方式

    由兔耳缘静脉注射20g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉动物,俯卧位四肢固定,剪除臀部和下肢的毛发,在下肢后侧正中线在腘窝上方和臀大肌分别剪开皮肤,在两点肌间隙处分离,寻找并暴露坐骨神经上下两端,潜行分离坐骨神经。自坐骨神经分支上方处用不同电压值的交流电(55,110,220V)电损伤3cm神经,通电时间为3s, 缝合伤口后按不同观察期限取材。(见图1.2


 

1.1  变频实验电源电击现场

   

1.2  暴露坐骨神经并连接电源导线。

5 存活时间兔后肢的损伤情况:

    观察各致伤动物后肢的功能,及肢体远端的伤情等情况.

6 取材

    按损伤后即刻,1w,2w,4w,8w,16w6个不同时相点静脉麻醉兔子,剪去术区毛发,消毒铺单,手术暴露坐骨神经,仔细剥离坐骨神经,以两处电击点中间处剪取坐骨神经约2cm,放置于装有PBS的培养皿中,在外科显微镜下仔细剥离神经外膜,分离出单个神经束,剥离神经束膜,制成大小约1mm×1mm×2mm 小块电镜样品标本。

7 透射电镜样品制备

将所制备标本置于3%戊二醛溶液中固定12h0.1%PB漂洗两次,1%锇酸后固定2h0.1%PB漂洗两次,不同浓度丙酮溶液梯度脱水,环氧树脂浸透过夜包埋,镜下观察定位,后制成超薄切片,电子染色、烘干,透射电镜观察。

 

 


 

   

1 实验动物数量分析: 

    纳入动物72只,均记入结果分析,无脱落。

2 一般观查:

    55V损伤组即刻神经纤维外观无明显变化,1w时观察神经轻度水肿,以后各时间点上观察神经形态正常,后肢功能未见明显受限。

    110V损伤组即刻发现神经纤维与电极接触区域颜色变暗,1w时观察神经水肿、颜色发红、与电极接触处有梭形神经瘤形成,2w周后观察神经水肿减轻、质脆、颜色基本恢复正常,后肢功能受限,4w时观察神经颜色正常,神经瘤变小,后跟部出现皮肤溃疡,16w时观察神经形态正常,与电极接触点同于正常神经,后肢功能轻度受限。

    220V损伤组即刻整个损伤神经段发黑,1w后神经水肿与周围组织粘连、质脆,2w后观察神经颜色恢复正常、水肿减轻、与电极接触点神经瘤膨大,4w后观察神经颜色恢复正常、质地变硬如索条、不易拉断、未见与周围组织粘连,后肢后外侧静脉(大隐静脉)呈透明状、水肿,动物后肢功能完全受限,后跟溃烂,8w时神经质地变柔软、神经瘤变小,16w时观察神经干老化、与电极接触点有肉芽包裹、质硬,后肢功能受限、长期呈屈曲位。

3 电镜观察: 

   正常神经组织电镜下观察见神经纤维截面形状近似圆形,轴突外有雪旺氏细胞质膜形成的髓鞘紧密包裹,轴突内轴质均匀、微管、微丝(神经细丝)可见,髓鞘板层质地均匀、排列紧密、中间无裂隙,雪旺氏细胞核形状较规则、核孔不扩张、核内线粒体等结构清晰(Fig1)。

    55V神经损伤组:1w时,镜下观察有髓神经纤维髓鞘板层模糊、中间出现裂隙或小空泡,轴突内微丝、微管等细胞器紊乱,雪旺氏细胞轴突复合体无明显改变(Fig2)4w时,有髓神经、无髓神经结构已恢复正常.空泡现象消失,雪旺氏细胞形态正常。16w时,神经结构未发现异常。

    110V神经损伤组:2w时,受损的神经纤维数目明显增加、损伤程度加重、但神经纤维截面形状基本正常。表现为无髓神经纤维轴索变形、轴膜破裂、轴浆外溢(Fig 3),有髓神经纤维髓鞘模糊、板层松解、间隙增多、部分空泡化,轴质内微管微丝消失、呈均质状态,雪旺氏细胞形态结构无明显改变、但数量上明显增多,仍可见到形态结构正常的神经纤维(Fig 4)4w时,可见到新生的神经纤维,新生的神经纤维由雪旺氏细胞质膜形成髓鞘逐渐包裹(Fig 5)8w时,再生的神经纤维结构进一步成熟,可见新生髓鞘较薄、但外层光滑,亦可见到尚未完全形成包裹的板层髓鞘,空泡化现象减少,无髓神经纤维数目减少、但直径增大,雪旺氏细胞包裹的无髓神经纤维数目减少、并处于细胞的外层,胶原纤维无明显增加。16w时,神经纤维形态结构基本恢复正常,雪旺氏细胞数量减少。   

    220 V神经损伤组:2w时,神经组织受损数量大增、损伤严重,表现为神经纤维截面形状不规则、凸凹不定,髓鞘模糊、板层厚度不均、局灶性松散、大量空泡化、严重的局灶性变性融合为疏松蜂窝状、甚至分离,雪旺氏细胞数量减少、核形态不规则、核膜破裂或核孔扩张、线粒体模糊、内质网扩张(Fig 6)。毛细血管内膜凹凸不平、线粒体部分溶解消失、内质网扩张、异染色质凝聚靠近核膜(Fig7)4w时,髓鞘板层裂缝、空泡、变形,雪旺氏细胞核周可见空泡、核膜部分溶解破裂、核内线粒体模糊(Fig 8)8w时,血管内膜凹凸不平加重、管腔完全闭塞,胶原纤维含量开始增加。16w时,雪旺氏细胞核周间隙增大、扩张,核内线粒体空泡化、内质网扩张,胶原纤维增多(Fig 9)

 

                          

1  正常神经纤维结构(TEM x 12000

 

                           

2  有髓神经纤维髓鞘板层模糊,轴突内微丝、微管等细胞器紊乱 (TEM x 20000)

                           

3  神经纤维轴索变形、轴膜破裂、轴浆外溢(TEM x 4000)

                               

4  有髓神经纤维髓鞘空泡化,轴质内微管微丝消失,雪旺氏细胞数量上有增多

(TEM x 2500)

                             

5  新生的神经纤维由雪旺氏细胞质膜形成髓鞘包裹(TEM x 10000)

                            

6  神经纤维截面形状不规则,髓鞘疏松蜂窝状、甚至分离,雪旺氏细胞核形态不规则、核膜破裂或核孔扩张、线粒体模糊、内质网扩张 (TEM x 2500)

                           

7  毛细血管内膜凹凸不平、线粒体部分溶解消失、内质网扩张、

异染色质凝聚靠近核膜(TEM x 15000)

 

                           

8  髓鞘变形,雪旺氏细胞核周空泡、核膜部分溶解破裂、核内线粒体模糊(TEM x 12000)

                            

9  雪旺氏细胞核周间隙扩张,核内线粒体空泡化、内质网扩张(TEM X 12000)

 

   

    以往有过关于周围神经电损伤后病理改变的报道,但这些报道中对于电损伤后神经组织的超微结构变化缺乏长期细致的观察,本文在电镜下对电损伤后周围神经组织的病理改变及其随后再生过程进行了长期细致的观察,试图从病理改变上揭示神经电损伤后病理机制。

1 雪旺氏细胞在周围神经再生中的作用:

    本实验观察到周围神经电损伤后神经再生并不是单纯的轴突新生,而是以雪旺氏细胞的增多为引导,继而出现新生的神经纤维。表现为110V神经损伤组:2w时,雪旺氏细胞数量上显著增多,4w时,可见新生的神经纤维,并由雪旺氏细胞质膜形成髓鞘逐渐包裹,16w时,神经纤维形态结构基本恢复正常。从实验结果看雪旺氏细胞的增殖高峰期出现在伤后的2w左右,这种活性高峰与Mackinnon SE[64] 研究神经切割伤时的结果一致。考虑是在电损伤后,雪旺细胞由于受局部损伤所致炎症反应刺激而处于预激活状态[65],处于激活态的雪旺氏细胞增殖能力更加旺盛[66]。此外,220V神经损伤组雪旺氏细胞遭到破坏,数量上减少,观察16w仍未见神经纤维恢复正常。在时间等其他作用情况一致的情况下,损伤电压的增高(220V),所致电致微孔作用及热效应都显现较电压低时明显,致细胞的结构破坏严重,是细胞电损伤后不可恢复的状况原因。

2  周围神经电损伤后神经纤维的变化规律

    实验结果说明神经电损伤中存在神经纤维变性、坏死和神经纤维再生的两种相反方向的动态变化,但是这种动态变化是不平衡的,较低电压(55V110V)神经损伤后神经元轴突再生活性增强,以再生占主导地位,而损伤电压增高至一定值(220V)则以持续性损伤为主导,在所观察期限内出现不可逆性恢复。本研究结果还显示能够再生的神经组织中,随损伤的加大新生的神经纤维数量上有增多的趋势,因此,我们认为是神经的这种再生趋势决定其肢体功能和感觉恢复快慢。另外指出,是否220V为实验性电损伤兔坐骨神经不可逆性恢复的临界电压值,尚需实验数据支持。

3 周围神经电损伤后病理改变机制

    1)电流对神经纤维的直接损害,周围神经组织所造成的损伤主要通过两条途径:一是Baxer 提出的电流通过组织产生的热能造成的损伤,二是 Raphael等提出的电流通过组织时破坏了细胞膜的结构使细胞溶解,组织遭到损伤。本实验研究发现,电压较低时(55V)主要的改变是轴突内细胞器的溶解消失,而轴突结构没有遭到破坏,所以主要是电流造成的损伤。损伤电压增加时(110V),神经纤维结构性损害逐渐加重,热能的损害逐渐显现。(2)电损伤后的缺血性改变,由试验结果可看出,55V110V损伤组均未见到明显的血管病理改变,说明电流的直接损伤对血管损害较小。220V损伤组镜下见血管内膜改变及管腔内的血栓形成,大体见大隐静脉透明、水肿,说明热力是血管损伤的主要原因,神经内外的血管受损,进一步损害微循环,局部缺血可以使髓鞘代谢受到抑制,引起髓鞘的病理改变。雪旺氏细胞水肿,变性坏死,线粒体消失,这均与细胞的缺血缺氧有关。(3)胶原纤维增多使神经再生受阻。实验结果表明,随着损伤电压的增大神经内胶原纤维逐渐增多。胶原纤维的增多首先可以阻碍再生神经的生长,另外由于其牵拉的作用使神经内微环境遭到破坏,再生困难。[15]

 

 


 

实验二  兔坐骨神经实验性电损伤后雪旺氏细胞细胞周期及DNA含量分析

    

周围神经损伤后,远侧端发生瓦勒氏变性,轴索和髓鞘完全崩解,但雪旺氏细胞作为周围神经支持与营养细胞却会分裂增殖,在神经再生过程中发挥重要作用。神经电损伤作为一种特殊类型的神经损伤,有别于其它类型损伤,其特点是神经连续性存在可是神经内结构受损,包括雪旺氏细胞。这就给神经电损伤提供了一个不同于其它类型损伤的先决条件。人们目前对周围神经电损伤后雪旺氏细胞的演变过程少有研究报道。研究发现细胞周期是与细胞的增殖重要指标。为此本实验利用流式细胞仪,对电损伤后兔坐骨神经雪旺氏细胞细胞周期及DNA含量进行分析,了解雪旺氏细胞增殖的情况。

 

 


 

实 验 材 料

1 主要实验仪器:

倒置显微镜              Nikon

外科显微镜              Moller-wepel

显微外科器械            自购

HLS-BX变频实验电源    上海浦江电表厂

小接触面电极            自制

净化工作台              苏州净化设备厂

CO2细胞培养箱           德国Heraeus公司

离心机                  赛特湘仪离心机仪器有限公司

电子天平                Sartorius

圆筒式不锈钢过滤器      绍兴卫星医疗设备有限公司

    流式细胞仪              第四军医大学免疫教研室

2 主要实验试剂:        

胎牛血清﹙FCS        民海生物公司

胰蛋白酶                GIBCO公司

胶原酶                  GIBCO公司

戊二醛                  西安化学试剂厂

s-100蛋白抗体                       武汉博士德生物工程公司

 

  主要试剂配制:

1.0.25%胰酶           2.5g胰蛋白酶溶于1000mlD-Hanks平衡盐溶液中,过滤除菌,4保存。

    2.0.2%胶原酶          0.125g胶原酶溶于100mlD-Hanks平衡盐溶液中,过滤除菌,4保存。

    3.PBS                 137mmol/L NaCl,2.7 mmol/LKCl,

4.3 mmol/L NaH2PO41.4 mmol/L KH2PO4,调节PH值到7.4

    4.20DMEM培养液    按产品说明配制,加入青霉素100u/mL,加入链霉素100u/mL,按最终体积的20%加入胎牛血清,过滤除菌,4保存。

3 实验动物(同实验1)

      


 

实 验 方 法

1 动物实验环境(同实验1)

2 实验动物分组:

    中国本兔(第四军医大学实验动物中心提供)共52只,雌雄不拘,体重2-2.5Kg,随机按损伤电压大小分为55V损伤组、110V损伤组、正常对照组3,采用电损伤仪进行损伤。每组按观察期限再分为电损伤即刻、3d1w2w4w8w6个小组, 每小组4只动物。

3 实验装置及致伤参数(同实验1)

4 实验动物准备及致伤方式(同实验1)

5 取材:

按损伤后即刻、3d1w2w4w8w6个不同时相点静脉麻醉兔子,剪去术区皮毛,消毒铺单,手术暴露坐骨神经,仔细玻璃坐骨神经,以两处电击点中间处剪取坐骨神经约2cm,放置于装有PBS的培养皿中,在外科显微镜下仔细剥离神经外膜,分离出单个神经束,剥离神经束膜, 反复冲洗几次,用显微外科剪将其剪成2mm3大小的碎块,加入无菌干燥试管中。

6 雪旺氏细胞单细胞悬液的制备 

37水浴条件孵箱中,0.25%胰蛋白酶消化30分钟,然后加入少量培养液中止反应,轻轻吹打数次,100目滤网过滤,将未完全消化的神经组织继续用0.2%胶原酶37水浴条件下消化1小时,用含血清的培养液终止,吸管将其吹散,离心800rpm/min,6min。去上清,将沉淀悬浮于20%DMEM培养液中,培养皿底部预先涂有多聚赖氨酸,差速贴壁尽量除去成纤维细胞杂质,取培养1周的细胞进行实验观察鉴定。另取同样消化好的的单细胞悬液加入无水乙醇2ml,PBS1ml,固定细胞,送流式细胞仪检测。

7 雪旺氏细胞的鉴定:

在分离雪旺氏细胞时预先在培养皿中放置1cm×1cm大小并涂有多聚赖氨酸的玻片,待细胞贴壁完全后,取出小玻片,标本用0.01%磷酸缓冲液﹙PBS﹚冲洗两次,每次3分钟,洗净后用冷丙酮固定5分钟,3H2O2去离子水孵育10分钟,以消除内源性过氧化酶活性。蒸馏水冲洗,0.01%磷酸缓冲液﹙PBS﹚浸泡5分钟,正常封闭用山羊血清工作液室温孵育15分钟,倾去。滴加1100兔抗S-100β抗体﹙一抗﹚,4过夜,0.01%磷酸缓冲液冲洗3次,每次3分钟。滴加生物素标记山羊抗兔IgG﹙二抗﹚,室温孵育15分钟,0.01%磷酸缓冲液冲洗3次,每次3分钟。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液﹙S-A/HRP, 室温孵育15分钟,0.01%磷酸缓冲液冲洗3次,每次3分钟。准备1毫升双蒸水,加入约50微升0.05%浓缩缓冲液,混合均匀,然后加入0.05%双氧水和0.05DAB各一滴混匀,滴加于玻片上显色10分钟,显微镜下观察。

8 流式细胞分析样品的制备:

    70%预冷乙醇固定的单细胞悬液200ul500g离心5min,悬浮管底的细胞沉淀,在细胞悬液中加2mlPBS,混匀后300g离心5min,弃上清液。流行约50ul的细胞悬液,加100ulRNase溶液,37°C水浴30min.加入800ulPBS50ulPI染色液,避光染色30min,2—8°C冰箱避光保存,4h内进行流式细胞分析检测。 

9 统计学处理:

采用SPSS10.0版本进行统计学处理,实验数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析方法,P<0.05为有显著性差异。


 

    

1 雪旺氏细胞鉴定:

倒置显微镜下见雪旺氏细胞呈长梭形,多为双极,极较长,核为长梭形或椭圆形,可见特异的细胞束,呈栅栏状,相对或并排排列。抗S-100蛋白免疫组化染色,细胞浆呈棕褐色,核梭形或椭圆形,胞体有两个或多个细长突起,这些结果说明所分离的确为雪旺氏细胞(见图2.1-2.2)。    

2.1  55V电损伤后1w培养5天的雪旺氏细胞  倒置显微镜(X400

            

2.2  55V电损伤后雪旺氏细胞的S-100染色(免疫组化染色,×200

2 雪旺氏细胞流式细胞周期与DNA倍体分析直方图之一    (见图2.3):

2.3  FCM分析结果示:雪旺氏细胞群细胞周期所占的百分比及DNA定量

3 统计结果: 见附表2.1及图2.33组动物损伤区域神经雪旺氏细胞周期及DNA倍体分析中,其中损伤后1表达最为显著;55V组及对照组之间比较无显著性差异(P > 0.05;而110V表达水平较低,与其他它两组有显著性差异(P < 0.05)。

2.1  损伤后各组雪旺氏细胞周期DNA含量G2/G1的表达( x ± s)

 


                                             伤后时间(w) 

     n

                0        3(d)        1        2          4          8

 

55V    24  1.94±0.07    1.90±0.06   1.96±0.05   1.98±0.06     1.97±0.07    1.96±0.10

110V   24  1.61±0.03*    1.43±0.07*  1.88±0.04*  1.90±0.07*    1.79±0.06*   1.75±0.08*

对照组    4   1.97±0.06        ----        ----         ----          ----          ---

注:110V组与55V组及对照组比较,*P <0.05     55V与对照组比较P >0.05

    

电损伤是神经损伤的特殊形式,神经受损区域整体在瞬间损伤,包括轴突髓鞘雪旺氏细胞等,变性过程快而全面,电压不同对神经损伤的程度也不同。因此本实验通过不同电压损伤兔坐骨神经后雪旺氏细胞细胞周期及DNA含量表达水平来了解不同电压损伤对雪旺氏细胞增殖水平的影响。

研究表明,雪旺氏细胞的增殖与神经损伤后神经变性的时间有关。本实验两组神经电损伤后雪旺氏细胞的DNA合成能力有抑制增加平稳的现象DNA合成在受伤即刻即低于正常对照,提示电击伤对DNA有直接的不同程度的损害,之后继续下降至伤后第3天达到最低点。显示DNA的降解在前3天内要低于合成,其机制可能与电场作用下DNA合成相关的酶蛋白构象改变有关。其中损伤后1w2w DNA的合成能力变为显著,2w时达到顶峰后开始下降,损伤2w后随着时间的延长其表达水平呈下降趋势,Clemence67等用3H胸腺嘧啶脱氧核酸和双重抗体标记观察雪旺氏细胞在神经损伤后的分裂变化,结果发现雪旺氏细胞的有丝分裂始于损伤后第2天,在2w左右达到高峰,与本研究结果一致。可以看出周围神经损伤后早期雪旺氏细胞大量增殖, DNA合成能力与损伤后雪旺氏细胞分裂增殖水平在时间上保持一致,而且存在一定的剂量效应,55V组及对照组之间DNA合成比较无显著性差异(P > 0.05),其原因我们认为在于55V的热损伤效应没有构成对雪旺氏细胞的明显损伤,因此未造成其DNA合成能力的改变。而110V合成的表达水平较低,与其他两组存在显著性差异(P < 0.05),说明加大电损伤幅度会使雪旺氏细胞损伤加重,可能直接造成了组成某些DNA合成蛋白的损伤甚至蛋白结构改变,因此DNA合成能力的表达影响程度加大。李学拥等在实验中发现,电压较低时(50V)主要的改变是轴突内细胞器的溶解消失形成空泡样改变,而轴突结构没有遭到破坏,所以电流对雪旺氏细胞造成的损伤较小,因此一定电压幅度的电损伤会出现雪旺氏细胞大量增殖。而随着损伤电压的增加,热能的损害逐渐显现,神经纤维结构性损害逐渐加重,直至出现不可逆的病理改变,影响到包括DNA合成酶在内许多大分子蛋白的活动,导致100V电损伤组DNA合成能力水平比其它他两组低。可见较低电压损伤对雪旺氏细胞损伤较小,对DNA含量的表达影响程度较轻,细胞增殖水平较高;随着损伤电压的增大,雪旺氏细胞损伤加重,对DNA合成能力影响程度加大,故雪旺氏细胞增殖水平反比降低。


 

本课题通过实验性电损伤兔坐骨神经动物模型,对不同电压损伤兔坐骨神经后神经组织及雪旺氏细胞超微结构进行了观察,以初步了解雪旺氏细胞电损伤后结构变化机制。并通过对雪旺氏细胞周期及DNA含量的表达变化进行实验研究以了解不同电压损伤对雪旺氏细胞增殖水平的影响,得出以下结论:

1.      雪旺氏细胞在受到电损伤后超微结构随损伤电压的增大而改变明显;

2.      低电压损伤兔坐骨神经后雪旺氏细胞DNA合成能力增加,随着损伤电压的增加,DNA合成能力的降低;55V110V电压下,电损伤1w后随着时间的延长雪旺氏细胞DNA合成能力呈下降趋势

 


 

 

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个人简历和研究成果

 

1.      995.9-2000.7                  长春中医学院                                学生

2.      2000.7-2005.9               中国人民解放军第65316部队                军医

3.      2005.9-2008.6               第四军医大学唐都医院整形烧伤科在读硕士研

究生,导师:李学拥,主要从事周围神经电损

伤方面研究。

                

研究生学习期间发表文章

1.      魏彦立,李学拥,. 兔坐骨神经实验性电损伤后神经神经组织观察,实用医学杂志,2008,6(3):265-268

2.      魏彦立,李学拥,. 兔坐骨神经实验性电损伤后雪旺氏细胞周期及DNA倍体分析,中华烧伤杂志,(待刊)

3.      魏彦立,李学拥,. 兔坐骨神经实验性电损伤后雪旺氏细胞调亡研究,中华烧伤杂志,(待刊)

4.      魏彦立,李学拥.雪旺氏细胞及其离子通道在周围神经再生中的作用(待刊)

 

 

 

 

 

 

   

 

在我三年的研究生学习即将结束的时刻,谨向所有关心、支持、理解、帮助过我的人们致以最诚挚的谢意:

    衷心感谢我的导师李学拥教授!导师对我的课题从实验阶段到论文撰写,以及临床工作的学习,始终给以亲切的关怀、鼓励和热情指导。导师那与时俱进的思想、深刻的洞察力、孜孜不倦的敬业精神、高尚的师德、宽广的胸怀以及炉火纯青的手术技巧无不给我留下深刻的印象,使我终身收益。不仅在现在,而且在将来都会成为我学习的榜样。谆谆教诲,师恩不忘!

衷心感谢陈绍宗教授在本课题以及工作生活中给予我的关心!

在实验进行过程中,我得到了整形烧伤科所有医护人员无私的指导和帮助,特别致谢雷战军技师、陈瑞技师给予的帮助和支持,同时感谢我的同学王志刚硕士、谭家麒硕士,感谢你们的帮助!

衷心感谢第四军医大学电镜中心王春梅主任、黄晓峰副主任;感谢免疫教研室曹云欣老师,是您们的指导和帮助保证了实验的顺利进行!

在临床学习期间,得到了李跃军副主任、李望舟副教授、吕小星主治医师、孙超峰主治医师、李金清博士、李靖博士、蒋立博士、袁焱琴护士长及整形烧伤科全体医护人员的最无私的关怀和最宝贵的指点,我深深感受到了整形科这个大家庭的温暖!整形烧伤科群英荟萃,各位老师的殷殷之情充盈我心,实难一一详诉,本人定当铭记于心。