设为首页 收藏本站
您所在的位置:
首页 >> 教学信息 >> 论文 >> 正文

金玉峰学位论文

作者:
发布日:2010/7/25 16:58:47

独 创 性 声 明

 

秉承学校严谨的学风与优良的科学道德,本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。

申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。

 

         论文作者签名:             日期:              

 

 

 

保 护 知 识 产 权 声 明

 

本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定,即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容(含电子版,保密内容除外),可以采用影印,缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅,并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。

 

 论文作者签名:         导师签名:           日期:           

 

 

 

     胰岛素局部应用对大鼠慢性创面愈合的影

响及初步探讨

 

 

研 究 生:金玉峰        

学科专业:外科学(整形)

所在单位:第四军医大学唐都医院

整形烧伤科

    师:陈绍宗 教授(主任医师)

辅导老师:李学拥 教授

 

                             

关键词  胰岛素;慢性创面;创面愈合;血管内皮生长因子

 

 

中国人民解放军第四军医大学

2009 05

 

 

 

 

 

       

 

缩略语表…………………………………………………………4

中文摘要…………………………………………………………5

英文摘要…………………………………………………………7

    …………………………………………………………10

文献回顾…………………………………………………………12

    …………………………………………………………27

实验    胰岛素局部应用对大鼠慢性创面愈合的影响及初步探讨

1.材料和方法    ………………………………………………27

2.            ………………………………………………30

3.           ………………………………………………31

            ………………………………………………41

参考文献…………………………………………………………42

个人简历…………………………………………………………51

发表文章…………………………………………………………51

    …………………………………………………………52

 


缩略语表

 

缩略语     英文全称                    中文全称

IN           insulin                           胰岛素

VEGF       Vascular endothelial growth factor      血管内皮生长因子

AGEs         Advanced Glycaˉtion End Products   基化终末产物

GF          PlacentaGrowth Factor               胎盘生长因子

IHC         immunohistochemistry               免疫组织化学

FN          fibronectin                         纤维连接蛋白

bFGF        basic fibroblast growth factor          碱性成纤维细胞因子

EGF         epidermal growth factor              表皮生长因子

TNF         tumor necrosis factor                 肿瘤坏死因子

PDR        proliferative diabeticretinopathy   增殖性视网膜病变

ECM          extracellular matrix                 细胞外基质

IGF1 insulinlike growth factor1       血清胰岛素样生长因子一1

V.A.C.       Vacuum-assisted closure               封闭负压引流技术

IRS   Insulin Receptor Substrate               胰岛素受体底物

PKB       Protein Kinase                        蛋白激酶B

HE        hematoxylin-eosin                         苏木精-伊红染色

 

 

 

 

 

 

 

 

       

   胰岛素局部应用对大鼠慢性创面愈合的影响及初

                  步探讨

 

   硕士研究生:金玉峰

          师:陈绍宗教授(主任医师)

第四军医大学唐都医院整形烧伤科,西安  710038

 

中文摘要

 

创面愈合是一个复杂而有序的生物学过程,其过程一般包括:创面的止血、炎性反应,细胞的增殖、分化、上皮化、迁移以及基质的合成,成熟和重塑。创面愈合过程中组织需要充足的营养,能量代谢加大,因此良好的微循环功能是创面正常愈合的保证。

胰岛素(insulinIN)是一种蛋白质类激素,主要由胰岛β细胞分泌。既往的研究表明胰岛素具有多种生物学作用,能够促进蛋白质合成、纠正负氮平衡,临床上主要用来治疗糖尿病,也用来治疗缺血性脑血管病等。有研究显示,胰岛素可参与创面愈合过程炎症反应阶段多个环节的调控,在局部组织的释放可以促进内皮细胞的分裂。近年来关于胰岛素和血糖调控对热力烧伤创面的影响日益受到重视,已见一些研究资料报道。值得注意的是国内一些作者纷纷报道胰岛素局部应用可促进创面愈合,国外也有个别报道用胰岛素凝胶治疗大鼠皮肤溃疡的报道。然而,如果确实有效的话,应在何时用,用量是多少,尤其是局部应用的作用机制是什么?这些问题尚缺少实验依据,有待回答。本实验拟采用大鼠背部皮肤慢性创面模型,初步观察局部应用外源性胰岛素后创面愈合情况,大鼠血糖的变化,创面血管形成和VEGF水平的变化情况,为进一步探讨其作用机制作准备。实验分为以下3部分。

以大鼠背部2.0cm直径圆形皮肤缺损创面为模型,将45只动物随机分成A组对照组(单层油纱布)、B组(4单位胰岛素)和C组(8单位胰岛素),每组15只。

1术后第8天各组随机取5只大鼠,用无菌透明载玻片覆盖创面,用记号笔沿创面边缘描绘出创面,再用平整厚度均匀的透明塑料膜复制并剪下该创面图样,以万分之一电子分析天平测定透明塑料膜图样的质量,并换算成相应创面的面积(首先测定透明塑料膜单位面积的质量,mg/cm2);并计算各组创面愈合率,创面愈合率=原始创面面积—剩余创面面积/原始创面面积。结果:原始创面面积为3.14±0.10 cm2A组创面面积为2.5±0.13 cm2B组创面面积为2.05±0.09 cm2C组创面面积为1.98±0.13 cm2A组与B组和C组相比,有明显统计学差别(P < 0.05);而B组和C组之间无统计学差别(P > 0.05)。A组创面愈合率为20.38±4.06 %B组创面愈合率为34.71±2.89 %C组创面愈合率为36.94±5.41%A组与B组和C组相比,有明显统计学差别(P < 0.05);而B组和C组之间无统计学差别(P > 0.05)。

2术后第8天各组随机取5只大鼠,测每只大鼠的血糖值,并分别在创面中心及周围各取直径1 cm,厚度3 mm的区域作为组织标本,通过HE染色检测创面毛细血管。结果:B组和C组较A创面毛细血管增生明显增加。术前正常大鼠为:10.63±0.24 mmol/ LA组为10.86±0.38 mmol/ LB组为9.84±0.58 mmol/ LC组为9.69±0.43 mmol/ LA组与B组和C组相比,有明显统计学差别(P < 0.05);而B组和C组之间无统计学差别(P > 0.05)。   

3.术后第8天各组随机取5只大鼠,取创面中心区直径1 cm,厚度3 mm的区域作为组织标本,通过(RT-PCR)检测VEGF。结果:同A组相比,B组和CVEGF mRNA表达有明显增高的趋势(P < 0.05),CmRNA表达略高于B组的VEGF mRNA表达,但两组之间无明显统计学差异(P > 0.05)。

结论: (1)大鼠慢性创面外用胰岛素进行治疗后,创面愈合率增加(2)大鼠慢性创面外用胰岛素进行治疗后,血糖有一定的下降趋势;同时创面毛细血管增生明显增加。(3)胰岛素可以通过上调VEGF mRNA,增加毛细血管数量促进创面愈合。

 

【关键词】  胰岛素;慢性创面;创面愈合;血管内皮生长因子(VEGF

 

 

 

 

 

Primary Study and Effect of Externally Applied Insulin on Treatment of Chronic Wound of Rats

 

Candidate for master:  Jin Yu-feng

Supervisor: prof. Chen Shaozhong

Department of plastic and burns surgery ,Tangdu hospital,

                Fourth Military Medical University, Xi’an ,710038,China

 

Abstract

    Wound healing is a complicated and ordered biological course, which includes hemostasis of wound, inflammatory reaction, proliferation, differentiation,

epithelization and migration of cell,and synthesis, maturation and remodeling of matrix. The nutrition of skin is mainly provided by microcirculation. During the course of wound healing, the tissue needs sufficient nutrition and the energy metabolism is strengthened. So the favorable microcirculation function is vital for the normal wound healing.

Circulating insulin (from Latin insula, "island") is produced by beta cells in the Islets of Langerhans in the pancreas and has systemic effects. Previous studies have shown that insulin has a wide range of biological effects. Insulin can promote protein synthesis and correct the negative nitrogen balance. In clinical practice, insulin is  mainly used to treat for the diabetes and ischemic cerebrovascular disease. Some studies have shown that insulin may participate in the regulation of inflammatory response during wound healing, insulin released locally in tissues can promote endothelial cell division. In recent years, the effects of insulin and blood glucose control on thermal burn wounds have been reported in some studies. It is noteworthy that some authors have reported that local application of insulin may promote wound healing. In addition, there are also individual reports abroad about insulin gel for the treatment of skin ulcers in rats. However, the molecular mechanisms of local application of insulin insulin are largely unknown. The lack of this knowledge hampers the development of rational and efficient strategies to promote wound healing. After the local application of insulin in experiment rat model of chronic skin wounds, wound healing, blood glucose in rats, wound angiogenesis and changes in VEGF levels are observed. Our experiment is divided into 3 sections.

Fourty five animals were randomly divided into control group (vaseline gauze A), 4 units group (group B) and 8 units group (group C).

1. On the 8th day after surgery, five rats of each group were selected. Wounds were covered with aseptic transparent glass slide, drawing along the edge of the wound with a marker pen. Copy with a uniform thickness of the transparent plastic film and cut the wound pattern. The quality of transparent plastic film blueprint was measured in one ten thousandth of electronic analytical balance. Convert the quality into the corresponding wound area and calculate the rate of wound healing in each group. The rate of wound healing = (original wound area - the remainder of the wound area)/original wound area. Results: The original wound area was 3.14±0.10 cm2. The wound area of group A was 2.5 ± 0.13 cm2. The wound area of group B was 2.05 ± 0.09 cm2. The wound area of group C was 1.98 ± 0.13 cm2. The wound area of group C was statistically significant different from that of group A and group B (P <0.05); while there was not difference between group B and group C (P> 0.05).The rate of wound healing of group A was 20.38±4.06 %,The rate of wound healing of group B was 34.71±2.89 %,The rate of wound healing of group C was 36.94±5.41%,The rate of wound healing of group C was statistically significant different from that of group A and group B (P <0.05); while there was not difference between group B and group C (P> 0.05).

2. On the 8th day after surgery, five rats of each group were selected. Blood sugar was measured. Wound tissue in the center and the periphery (diameter 1 cm, thickness 3 mm) was obtained for HE staining. The total protein and wound capillaries was observed. Results: The blood sugar of the animals was 10.63±0.24 mmol / L. he blood sugar of group A was 10.86 ± 0.38 mmol / L. The blood sugar of group B was 9.84 ± 0.58 mmol / L. The blood sugar of group C was 9.69 ± 0.43 mmol / L. The blood sugar of group C was statistically significant different from that of group A and group B (P <0.05); while there was not difference between group B and group C (P> 0.05). The increase of wound capillary was more significant in group B and group C compared with group A, there was not difference between group B and group CP > 0.05.

3. On the 8th day after surgery, five rats of each group were selected. Blood sugar was measured. Wound tissue in the center and the periphery (diameter 1 cm, thickness 3 mm) was obtained for RT-PCR. Results: Compared with the group B and group C, the mRNA expression of VEGF in group A was significant upregulated. Although the VEGF mRNA expression of Group C was slightly higher than that of Group B,

Conclusion: (1) In wound healing experiment rat model of chronic skin wounds, the external application of insulin can increase the rate of increase. (2) After the external application of insulin, the blood sugar have a slightly decline. (3) Insulin can promote wound healing by increasing the number of capillaries and upregulating the VEGF mRNA expression.

 

 

Key words: insulin, chronic wound, wound healing,VEGF

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

前言

  

慢性创面是整形外科临床工作中经常遇到的难题之一,常见的类型有压力性溃疡,静脉淤滞性溃疡,糖尿病性溃疡等。整形外科对于创面的愈合和组织再生问题进行了大量的临床研究和实践。目前对创面愈合的研究已深入分子和基因水平,近年来亦对创面修复过程中的信号转导的进行了大量研究。虽然仍然缺乏对创面愈合完整而准确的认识,但是随着研究的深入,诊疗技术的发展及不断进步,对慢性创面的治疗效果有了一定的提高。尤其是近年来关于胰岛素和血糖调控对热力烧伤创面的影响日益受到重视,已见一些研究资料报道。值得注意的是国内一些作者纷纷报道胰岛素局部应用可促进创面愈合,国外也有个别报道用胰岛素凝胶治疗大鼠皮肤溃疡的报道。目前已有的相关研究中认为胰岛素促进创面愈合的机理可能是:局部应用胰岛素组织细胞通过主动摄取或扩散获得胰岛素调节糖类代谢、产生能量、促进氨基酸进入细胞合成蛋白质,胰岛素大能促进成纤维细胞的生长和胶原合成,促进创面毛细血管增生,使组织快速血管化,增加血流量,加快伤口愈合;加速无氧代谢,为炎性细胞活动提供能量、维持成纤维细胞活性,进而促进肉芽组织生长,加速创面愈合。

随着研究的发展,胰岛素受体及其底物表达变化与VEGF及其促血管新生作用之间的关系逐渐受到人们的重视。血管内皮生长因子(VEGF)作为一种特异性的血管内皮细胞有丝分裂原,与血管内皮细胞上VEGF受体结合后,能引起内皮细胞分裂、增殖和迁移,增加血管通透性,促进新生血管形成。影响VEGF表达的因素有缺氧、瘤基因、抑瘤基因、多种生长因子、高糖及高胰岛素水平等。近年来的临床和实验研究发现,胰岛素受体及其底物在糖尿病视网膜病、缺血性血管病、肿瘤等与新生血管形成密切相关疾病的病变组织、细胞中的表达明显异常。同时观察到,在这些病变组织中,胰岛素受体及受体后的信号转导途径的变化与VEGF表达的变化有明显的相关性。目前多数研究者认为, 胰岛素、胰岛素受体及其底物可通过多种信号途径诱导VEGF的表达,其中研究较多的有胰岛素受体底物-1 ( IRS-1) / 磷脂酰肌醇-3 激酶( PI-3 K) 瀑布、Ras-MAPK途径等。

    然而上述报道均只是对胰岛素促进创面愈合有效的临床报道,但对胰岛素促进创面愈合机理的研究并不象其在临床应用那样广泛。本实验拟采用大鼠皮肤慢性创面模型,初步观察局部应用外源性胰岛素后创面愈合情况,大鼠血糖的变化,创面血管形成和VEGF水平的变化情况,证明其是否有效,并为进一步探讨其作用机制作准备。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

文献回顾

创面修复是整形外科多年来重点研究的方向之一,随着组织病理学、生物化学、药物学、生物材料学以及外科学等多方面学科的发展,对创面修复的发生机制与临床治疗取得了一定的成就,从而衍生出多种治疗慢性创面的方法与药物。而近年来关于胰岛素促进创面愈合的资料不断涌现,在临床治疗及试验中纷纷证实局部外用胰岛素有促进创面愈合的作用,然而涉及其作用机制的研究却很少,仅有少部分研究认为胰岛素促进创面愈合的机理可能是:局部应用胰岛素组织细胞通过主动摄取或扩散获得胰岛素调节糖类代谢、产生能量、促进氨基酸进入细胞合成蛋白质,胰岛素大能促进成纤维细胞的生长和胶原合成,促进创面毛细血管增生,使组织快速血管化,增加血流量,加快伤口愈合;加速无氧代谢,为炎性细胞活动提供能量、维持成纤维细胞活性,进而促进肉芽组织生长,加速创面愈合;胰岛素、胰岛素受体及其底物表达变化与VEGF及其促血管新生作用之间可能存在某种相关机制。

一.影响慢性创面愈合的因素

创面愈合是机体对损伤反应一个复杂而有序的生物学过程,一般表现为组 E 包括:创面的止血、炎性反应,细胞的增殖、分化、上皮化、迁移以及基质的合成,成熟和重塑。影响创面愈合的因素很多,包括机体的全身因素和局部因素两方面。全身因素包括:年龄因素、营养因素等。局部因素包括:感染、局部血液循环等。在上述因素的影响下,创面修复能力被削弱,而以损伤因素为主导,最终导致了难愈创面的形成。

1.全身因素

1.1年龄因素

    青少年的组织再生能力强,愈合快。老年人则相反,组织再生能力差,愈合慢,与老年人血管硬化、血液供应减少有很大的关系。

1.2 营养不良 

创伤后机体对于营养和能量的需求增加,若同时伴有由血管疾病、低血容量或组织水肿引起的组织灌注不良,则出现蛋白质、能量和各种微量营养元素(通常是各种维生素、微量矿物质各种必须氨基酸如精氨酸) 的绝对和() 相对缺乏。这些均可导致创面延迟愈合或经久不愈,其机制主要包括:合成激素的合成减少,蛋白质合成速率减慢和分解加快,蛋白缺乏等导致的免疫功能低下以及感染机会的增加。营养不良不仅使患者体质量下降,而且急性的创面更倾向于变为慢性。Harris 等统计,在制动和丧失去脂肪体重的的双重作用下,褥疮的发生率增加了74 %
 2.
局部因素

 2.1局部血液循环障碍或缺血

创面局部血运障碍会缺血是阻碍创面愈合的最主要原因之一,因为创面修复过程中必须的氧和营养物质只有经过血流才能输送到创面,而局部产生的大部分毒性物质及代谢产物等也主要经血流输送出创面。 

局部缺血既有血管本身的问题(如血管病变),也有血管外因素(如组织出血、水肿,压迫血管壁等)。在致伤因子的作用下,局部出现不同程度的组织和细胞损伤,进而启动了炎症反应过程,微动脉出现一过性痉挛,继而出现高流动相流动相血流淤滞相三个血液动力学改变。如果损伤银子持续或强烈,则低流动相延长,血浆外渗增多,血液粘滞度增加。同时,持续而剧烈的损伤必然导致持久、强烈的炎症反应,使组织氧耗量显著增加,代谢功能增强,从而在损伤去出现血液供应相对不足。而伤口周围组织出血、水肿,张力增加,压迫血管,使缺血进一步加重。而局部缺血必然引起组织细胞缺氧的放生,缺氧则成为局部缺血阻碍伤创面愈合的主要途径。

组织灌注不良在慢性创面形成中的作用已得到广泛认同,包括其引发的缺血缺氧,代谢产物堆积,以及缺氧诱发的中性粒细胞功能低下,这些都能造成创面愈合延迟。然而缺血再灌注损伤对难愈创面发生发展的影响近年来才逐渐得到重视。Mustoe1998)认为,在组织缺血基础上反复发生的缺血再灌注损伤也是影响难愈创面形成的重要因素之一。缺血再灌注损伤发生后炎细胞在趋化因子的作用下进入组织并释放促炎细胞因子、氧自由基等,同时N2O 的含量也会降低,造成血管收缩和组织无灌流现象,加重组织损伤。衰老细胞对缺血再灌注损伤的反应性更差,这可能是为什么老年患者更容易产生难愈创面的原因之一。创面缺氧对所有的创伤愈合都是有害的,在慢性创面的形成初期可能是主要原因之一,如糖尿病性下肢溃疡、压力性溃疡等都是由急性动脉阻塞引起的,此外,血容量不足和充血性心力衰竭可能影响灌注压和创面愈合反应[1]。组织缺氧是所有影响创伤愈合因素的共同作用途径,在许多创伤模型中都证实了缺氧的危害性[2]。组织内氧饱和度的重要性也由高压氧能促进慢性创面愈合所证实[3]。此外,缺氧会损害人体抵抗细菌的防御系统,使创面对感染的易感性增加。Wagner1988[4]证实高PtcO2可以促进膝下截肢患者残端的愈合。Sheffield1955[[5]则证实慢性不愈创面中组织氧分压很低。Falanga1995[6]对慢性创面的横切面进行了研究,证明创缘组织的氧分压可达90mmHg,而在创面中心几乎为零。以上结果提示,组织缺氧在慢性创面形成过程中的重要作用。由于组织修复主要是由修复细胞增值及合成、分泌细胞外基质来完成,组织缺氧也必然会通过影响组织细胞增值及基质的合成与分泌而阻碍创面愈合。

组织缺氧不但可以影响组织细胞增值、基质的合成与分泌,而且与伤口感染密切相关。Hopf1997)等对130例普通外科手术患者术后伤口感染发生情况进行了流行病学调查,发现组织缺氧与院内感染指数呈负相关;与院内感染指数相比,组织氧分压(PO2)能更准确的预测伤口感染发生的危险性。其认为局部学运及组织氧分压是机体免疫系统抵抗感染的重要组成部分,缺氧是导致局部抗感染功能下降及伤口感染的主要原因之一[7]

总之,局部组织缺血、缺氧不但可以抑制组织细胞增值及基质合成,而且可以导致局部抗感染功能下降,使创面容易发生细菌感染,而创面感染可以又加重组织缺氧及细胞损伤。缺血、缺氧及感染共同作用,使创面愈合障碍。

 2.2 细菌负荷、感染和坏死组织存留 

外伤后不可避免的会有各种细菌污染伤口或创面,不同的创伤及创面的不同部位污染细菌的种类和数量也是不同的,尽管创伤后细菌污染的伤口或创面不一定会发生感染,但污染的细菌可产生一些毒素和酶,引起组织溶解和坏死,加重组织损伤。

感染对伤口或创面修复的阻碍作用早已为人们所共识,机体的免疫系统及自然保护屏障则主要起防护感染的作用,任何原因引起皮肤自然屏障或机体免疫系统缺陷均会导致创面感染的发生。感染创面的愈合障碍主要识由于持续、剧烈的炎症反应造成,这些创面也只有等感染得到很好控制后方可治愈。

细菌负荷、感染和坏死组织存留互为因果。创面渗液和坏死组织不仅充当细菌良好的培养基,构成细菌逃避宿主免疫反应的屏障,增加感染机会。并能释放蛋白酶类和毒素降解生长因子,侵害创周相邻正常组织,形成阻止参与创面修复细胞移动和再上皮化的物理屏障。此外由于初次清创不彻底所遗留的坏死物质(主要包括纤维蛋白、变性的胶原和弹性蛋白) ,也可以通过形成纤维蛋白网对生长因子产生滞留作用,使创面愈合延缓。细菌负荷和感染都能增加炎症毒素和蛋白水解酶,延长炎症反应,增加坏死组织。需要注意的是,细菌负荷和感染不同。细菌负荷是指增殖的细菌多到足以损害创面修复,而并不一定导致感染。感染引起的合成性激素减少,分解性激素增加,感染高代谢状态和脓毒症,将会使创面愈合更加困难。创面愈合与创面中细菌种类和数量有关。对于大多数细菌来说,能够引起感染的菌数是105每克组织,如大于此值,创面的成功闭合率很低(19%),小于此值闭合率则为94%。但也有人认为大于105每克组织不一定就意味着创面感染。如有的研究证明仅仅出现大量的多种菌株未必能影响创伤愈合。这是由于细菌的浓度、毒力、生长特性固然重要,但宿主的抵抗力也同样重要。例如患有全身性疾病以及服用免疫抑制剂的人群就容易催患感染。而在宿主的抵抗力无特异性损害的时候,慢性创面多可清除这些足以使急性创面产生感染的微生物[8]

其次,创面感染与组织缺氧往往护卫因果。有研究表明,创面感染后大量分泌物及细菌产生的内外毒素等代谢产物通过血管活性激胎、不提激活系统或直接作用于血管内皮细胞,引起血管通透性增加,组织水肿加重,氧分压(PO2)降低至(20-30mmHg),可造成局部组织缺血坏死[9]。此外,Hohn1976)通过研究发现,缺氧状态下中性粒细胞的杀菌功能严重抑制,组织氧分压将抵制5mmHg以下时,中性粒细胞的杀菌功能降低50%[10]。因此,中性粒细胞杀菌功能抑制则使创面感染恶化,创面水肿及缺血、缺氧加重,这就造成感染缺血、缺氧中性粒细胞功能下降感染加重恶性循环。因而感染及其引起的组织缺血、缺氧对组织细胞增值抑制及损伤,进一步阻碍创面愈合。

二.胰岛素与创面愈合的关系

    胰岛素(insulinIN)是一种蛋白质类激素,主要由胰岛β细胞分泌。胰岛素可促进蛋白质的合成,促进成长,又可抑制蛋白质分解,通过促进各种氨基酸进入细胞内和促进糖的氧化,为合成蛋白质提供原料和能量,更可促进各种核糖核酸( RNA )的合成。胰岛素还有稳定溶酶体的作用,避免溶酶体中组织蛋白酶类的释放,从而减少组织蛋白质的分解,抑制糖的异生作用。既往的研究表明胰岛素具有多种生物学作用,能够促进蛋白质合成、纠正负氮平衡,临床上主要用来治疗糖尿病,也用来治疗缺血性脑血管病等[1112]胰岛素增加蛋白合成的功能提示其在创面愈合过程中可能发挥着一定作用,有关报道支持了这一设想[1314]

国内王卫红(1998)等在临床工作中使用胰岛素注射液局部外用治疗皮肤感染或其它原因而引起的创面延期愈合的患者213例,均取得很好的疗效,并认为造成创面延期愈合最常见的原因是致病菌破坏局部组织细胞修复,导致创面延期愈合[15]陆建芝(2001)在1998-2000期间采用胰岛素针4 U+生理盐水5-20ml给予19名糖尿病慢性创面患者行创面换药,同时配合应用降糖药物及抗生素治疗,取得很好疗效,溃疡愈合。认为胰岛素创面换药, 其作用机制尚不明确, 可能由于胰岛素能促进氨基酸进人细胞加速蛋白合成抑制蛋白分解。同时促进脂肪合成和抑制脂肪分解, 减少游离脂肪酸和丙酮生成, 能促进葡萄糖进人细胞。为此促进创面肉芽组织生长, 溃疡得到愈合[16]施庆忠(2007)等在1999.5-2003.5期间采用庆大霉素+胰岛素+生理盐水混合液治疗褥疮患者32例,褥疮治愈或创面面积再生皮肤生长取得良好的疗效。同时认为胰岛素是一种蛋白质,可以调节糖代谢,促进组织对糖的利用,它能降低局部组织的糖代谢,能加速葡萄糖的利用,抑制细菌生长,同时增加蛋白质的合成,促进组织修复[17]蔡敏纯(2008)在胰岛素辅助治疗慢性难愈合创面60例疗效分析中也有实验结果也表明,胰岛素在组织培养中能促进成纤维细胞增生及合成胶原,增加创面愈合过程中胶原沉积和张力强度;同时胰岛素能改变创面生长因子的组成,刺激创伤皮肤和肌肉的蛋白质合成,减少蛋白降解和肌肉消耗[18]。唐月学(2007)等通过大剂量胰岛素和生理盐水外敷治疗压疮患者16(实验组),常规剂量胰岛索和生理盐水外敷治疗压疮15(对照组),观察压疮愈合情况的对比治疗试验,结果证明外敷普通胰岛素8 Uml浓度配制成生理盐水胰岛素混合液治疗压疮患者的试验组在创面愈合率及愈合时间明显高于外敷普通胰岛素2 Uml浓度配制成生理盐水胰岛素混合液治疗压疮患者的对照组,且两组患者换药前后血糖值无显著性差异,采用8 Uml胰岛素生理盐水液外敷治疗压疮是相对安全的[19]卜秦琍(1999)等24例糖尿病足患者,在治疗DM 同时,采用局部654-2(山莨菪碱)加胰岛素、庆大霉素、甲硝唑混台液湿敷方法,使长期感染不愈台患者,取得了良好疗效[20]

    上述的临床治疗证明胰岛素确实有加强创面愈合的功能。并认为其机制可能是:局部应用胰岛素组织细胞通过主动摄取或扩散获得胰岛素调节糖类代谢、产生能量、促进氨基酸进入细胞合成蛋白质,胰岛素大能促进成纤维细胞的生长和胶原合成、创面血管化;抑制蛋白质、脂肪分解,促进局部组织细胞增殖,促进上皮细胞的生长,改善局部代谢;加速无氧代谢,为炎性细胞活动提供能量、维持成纤维细胞活性,进而促进肉芽组织生长,加速创面愈合。

王德强(2006)等在采用SD大鼠制作Ⅲ—Ⅳ°压疮模型,在创面外用不同剂量的胰岛素进行治疗的试验中,观察组织氧分压和pH值、血糖值、创面肉芽生长情况及愈合后组织形态等改变,研究发现胰岛素有成纤维细胞生长因子样作用,能促进成纤维细胞的生长和胶原合成,使细胞增殖周期启动,加速无氧代谢,提供炎性细胞活动的能量,维持成纤维细胞的活性,加快伤口愈合。能促进压疮区毛细血管增生,组织快速血管化,增加血流量,提高压疮区组织氧分压和pH胰岛素外用创面上能使基底细胞分裂以及DNA合成加速,迅速使创面上皮化,促进愈合[21]。付小兵(1999)等在表皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子促进创面修复效应的比较性研究的报道中同样认为胰岛素的成纤维细胞生长因子样作用可以刺激成纤维细胞复制,促进成纤维细胞生长增殖[22]

上述试验认为胰岛素促进创面愈合机制可能为:胰岛素不仅可以加速糖的无氧代谢,为成纤维细胞的生长增殖提供能量,促进创面毛细血管增生,使组织快速血管化,增加血流量,加快伤口愈合。更重要的是胰岛素的成纤维细胞生长因子样作用可以刺激成纤维细胞复制,促进成纤维细胞生长增殖,并合成大量胶原纤维;使基底细胞分裂以及DNA合成加速,迅速使创面上皮化,促进创面愈合。

柳晖(2009)等通过制作深Ⅱ度烫伤SD大鼠模型,创面下浸润注射等渗盐水(A)作为对照组,B组烫伤大鼠创面下浸润注射01 u胰岛素,C组创面下浸润注射600 IU重组人表皮生长因子,D组予Bc组相同剂量二者联合治疗的试验中观察各组创面愈合后的组织形态学改变。实验结果显示: rhEGF和胰岛素联合应用治疗的大鼠深Ⅱ度烫伤创面上皮细胞爬行出现得早,创面炎症轻,肉芽组织形成亦早。认为在低剂量EGF下,胰岛素和EGF促进细胞增殖的能力存在累加作用,这也许与胰岛素具有协调生长因子的作用分不开,胰岛素可协调增强角质细胞分泌表皮生长因子和层粘连蛋白的功能[23]。刘琰(2004)等制作深Ⅱ度烫伤大鼠模型。部分大鼠创面下浸润注射0110 u胰岛素,分别设为Bc组;以创面下浸润注射等渗盐水(A)和腹部皮下注射01 u胰岛素(D)的烫伤大鼠作为对照。观察各组创面愈合后的组织形态学改变,采用流式细胞仪对各组创面表皮细胞进行细胞周期分析。结论局部应用小剂量胰岛素能明显地促进烫伤大鼠创面愈合。认为创面局部应用小剂量胰岛素后修复细胞的分裂增殖能力增强,功能活跃,这可能是加速愈合速度,改善愈合质量的细胞学基础[24]

    由上述研究及结果可知,胰岛素局部应用治疗慢性创面在临床中已有较广泛的应用,并已取得了一定的疗效,对胰岛素促进慢性创面愈合提供了有利的佐证。但对胰岛素促进创面愈合机理的研究却少之又少,目前已有的相关研究中主要认为胰岛素促进创面愈合的机理可能是:局部应用胰岛素组织细胞通过主动摄取或扩散获得胰岛素调节糖类代谢、产生能量、促进氨基酸进入细胞合成蛋白质,胰岛素大能促进成纤维细胞的生长和胶原合成,增强修复细胞的分裂增殖能力,促进创面毛细血管增生,使组织快速血管化,增加血流量,加快伤口愈合;加速无氧代谢,为炎性细胞活动提供能量、维持成纤维细胞活性,进而促进肉芽组织生长,加速创面愈合。

三.血管内皮生长因子(VEGF)与创面愈合的关系

    皮肤组织主要依靠微循环提供各种营养。研究表明微循环的血流量和组织代谢活动水平相适应,创面愈合过程中组织能量代谢增加,需要充足的营养,因此良好的微循环功能是创面正常愈合的保证。

    血管内皮生长因子是l989Ferrara[25]在牛垂体星形胶质细胞体外培养液中分离并纯化的一种能够刺激血管增生、提高血管通透性的蛋白质性生长因子[26],具有较强的促肉芽组织形成和伤口愈合的作用。血管内皮生长因子(VEGF)是一种二聚体蛋白多糖,分子量是45KD4种异构体VEGF121 VEGF165 VEGF181VEGF206都是血管内皮细胞的特异性有丝分裂素[27]VEGF被认为是特异性最高,作用最强的促血管内皮细胞生成的调控因子。VEGF可选择性作用于血管内皮细胞,直接促进内皮细胞的增殖,还可以通过提高血管的通透性,使血浆蛋白渗入基质,利于内皮细胞的移行,间接促进血管生成[28]VEGF在成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞及肿瘤细胞等多种细胞中广泛的表达,但VEGF的受体(FLK 1/KDRFLT 1)仅由血管内皮细胞表达,因此它是一个特异作用于血管内皮细胞的因子。VEGF是血管新生的主要调控因子,作为动脉、静脉和淋巴管源性内皮细胞的分裂原,能诱导内皮中抗调亡蛋白质Bcl-2的表达,是促进内皮细胞增殖和存活所必需的。VEGF A基因部分缺陷可造成死亡率上升、发育受限、器官形成障碍,以肝脏尤为显著[29]VEGF A与子宫内膜血管新生及内皮修复有关[30],还参与卵泡的成熟和生长,其泡液中的浓度与卵泡和卵细胞的质量呈正相关,具有调节卵巢功能的重要作用[31];在骨骼生长和修复中,通过促进血管新生而使骨组织替代软骨组织[32]

    血管内皮生长因子能刺激血管增生和提高血管通透性,大量实验证明它在伤口的修复过程中起非常重要的作用。组织创伤后,在创面局部应用血管内皮生

长因子,可使创面周围组织毛细血管通透性增高,血浆中的大分子物质如纤维蛋白原等进入细胞外基质中,形成纤维蛋白凝胶等,从而作为暂时性支持新生血管和基质细胞的生长增殖,同时促进内皮细胞的分裂、增殖和迁移,加速新生血管的形成。另一方面,丰富的血液供应不仅可以为局部组织修复细胞的增殖、胶原的合成提供了足够的营养物质、氧气与其他生长因子,促进肉芽组织的生长,还为肉芽组织输送足够的炎症细胞,增强创面局部的抗感染能力,减少妨碍肉芽组

织生长的因素[33-37]Taub1998)等[38]在实验中发现,用血管内皮生长因子处理新鲜非缺血性伤口,其新生的肉芽组织较对照组多50 70 ;处理新鲜缺血性伤口,其新生的肉芽组织较对照组多100 150[39-40]Nishimura T2006)等在研究中发现血管内皮生长因子是强效的促内皮细胞有丝分裂原,新生血管的增加保证了细胞增殖、组织修复所必需的氧和营养物质的供给,对肉芽组织生长中有重要作用[41-43]。另外血管内皮生长因子可以调节细胞外基质,使其有利于细胞生长。如激发Ⅷ因子从内皮细胞释放,诱导基质胶原酶在内皮细胞表达等[44] Altavina D2001)等对瘢痕机制研究认为,血管内皮生长因子可以通过某种机制调节成纤维细胞的活性,影响胶原的代谢[45]。彭湃等(2007)在纳米微囊一血管内皮生长因子复合体对创伤组织中Bcl·2CD34表达的影响的实验研究中证明并支持了以上研究发现,认为血管内皮细胞生长因子的缺乏可能是慢性创面微血管生成障碍的一个重要机制,以及血管内皮细胞生长因子还可能通过对细胞外基质的合成及分泌的调节作用而影响创面的愈合[44]

    以往研究表明生长因子在创面愈合过程中起关键作用,其中VEGF已被证实

是惟一对血管形成具有特异性的生长因子[46],其能通过促进血管内皮细胞的增

殖、迁移而促进新生血管的形成,而其他一些因子对创面新生血管的促进作用也是通过提高VEGF的表达来实现的。VEGF参与了创面修复的各阶段,它可通过促进

创面新生血管的生长,对于创伤的愈合、减少瘢痕组织的产生和减少感染的发生尤为重要[37-38]

近年来的大量研究表明,生长因子可以在一定程度上促进创面愈合[49],而血管内皮生长因子(VEGF)就是其中一类,它最主要的功能表现在两个方面:(1),它在体内体外都特异性的促进血管内皮细胞的增值并诱导血管生成,是目前最强的促血管内皮细胞有丝分裂原;(2),它还可以增强微血管通透性,导致血浆蛋白广泛的外漏,其中包括纤维蛋白原,血浆酶原,纤维粘连蛋白等[50],这些蛋白直接或间接改变细胞外基层成分,使其形成暂时性新基质,许可并支持内皮细胞和成纤维细胞的迁移,有利于创伤的修复[51]

    综上可知,血管内皮生长因子(VEGF在创面愈合过程中能够促进血管内皮细胞的增殖、迁移而促进新生血管的形成,增强微血管通透性,改善慢性创面微循环,保证了细胞增殖、组织修复所必需的氧和营养物质的供给,对肉芽组织生长中有重要作用。另外血管内皮生长因子可以调节细胞外基质,使其有利于细胞生长;还可以通过某种机制调节成纤维细胞的活性,影响胶原的代谢。因此血管内皮生长因子(VEGF)对创面的修复有着重要作用。

四.胰岛素与血管内皮生长因子(VEGF)的关系

胰岛素是体内促进合成代谢、调节血糖浓度的主要激素,与分布在各种组织细胞上的胰岛素受体结合后,激活胞浆内各级靶蛋白,启动受体后信号传导途径,并参与胞核内多种基因的表达调控,在促进体内糖类、脂肪、蛋白质的合成代谢,促细胞生长、增殖中发挥重要作用。血管内皮生长因子(VEGF)作为一种特异性的血管内皮细胞有丝分裂原,与血管内皮细胞上VEGF受体结合后,能引起内皮细胞分裂、增殖和迁移,增加血管通透性,促进新生血管形成[52]。影响VEGF表达的因素有缺氧、瘤基因、抑瘤基因、多种生长因子、高糖及高胰岛素水平等[53-55]。近年来的临床和实验研究发现,胰岛素受体及其底物在糖尿病视网膜病、缺血性血管病、肿瘤等与新生血管形成密切相关疾病的病变组织、细胞中的表达明显异常[56-57]。同时观察到,在这些病变组织中,胰岛素受体及受体后的信号转导途径的变化与VEGF表达的变化有明显的相关性[58-61]

1 胰岛素受体的结构、分布及信号转导途径

    胰岛素受体存在于体内几乎所有的细胞膜上,在各类细胞上的受体数差异很大,如在肝和脂肪组织每个细胞可有20万个以上的受体,而在每个红细胞上约有40个受体。胰岛素受体属单个跨膜α螺旋的酪氨酸蛋白激酶受体型,是一种跨膜糖蛋白,由2个α亚单位和2个β亚单位构成四聚体。α亚单位由719个氨基酸残基组成,完全裸露在细胞膜外,是受体结合胰岛素的主要部位。β亚单位由620个氨基酸残基组成,分为3个结构域:N196个氨基酸残基伸出膜外;中间是含有23个氨基酸残基的跨膜结构域;C端伸向膜内侧,为蛋白激酶结构域,此区含有酪氨酸蛋白激酶活性,并有多个酪氨酸残基。

    胰岛素与细胞膜上的受体结合后,可激活β亚单位的酪氨酸蛋白激酶,使受体的酪氨酸残基磷酸化,从而导致β亚单位磷酸化,并与近膜区的胰岛素受体底物(IRS1IRS-2)结合,引起后者多个酪氨酸残基磷酸化。胰岛素受体是存在于胰岛素敏感的组织细胞胞浆内的传递胰岛素各种生物作用的信号蛋白,胰岛素受体经酪氨酸残基磷酸化后能与细胞内某些靶蛋白结合,主要激活细胞内的2条信号转导通路:①磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途径。通过与PI3KP85亚基结合并招募其催化亚基P110而激活PI3K,继而激活丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶或蛋白激酶B(PKB),最终导致葡萄糖转运体转位到细胞膜上,摄取葡萄糖。胰岛素的代谢功能主要通过这一途径进行;②酪氨酸蛋白激酶一Ras一有丝分裂原激活蛋白激酶(TPKRasMAPK)途径。受体与配体结合后,发生自身磷酸化并磷酸化中介分子Grb2SOS,使其活化,进而激活Ras蛋白,活化的Ras蛋白可进一步激活Raf蛋白,后者具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性,可激活MAPK系统,后者具有更广泛的

催化活性,最终磷酸化并激活转录因子,调节基因表达,这一途径主要参与促进细胞的生长和增殖[62]

2 VEGF及其受体的结构、分布及基因表达的调控机制

21 VEGF及其受体的结构、分布及作用

     VEGF1989年在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先纯化出来的糖类蛋白质。人VEGF基因位于6号染色体的短臂上,由8个外显子及7个内含子构成,基因全长28 kb,编码基因长14 kb,编码产物为同源二聚体糖蛋白,由分子量为1722 kD的相同亚基通过二硫键相连,由于其mRNA拼接不同具有5种形式,即VEGF121VEGF165VEGF1 89VEGF206 VEGF145,以VEGF165较为常见。正常情况下,某些富含血管的组织(如肾、胚胎组织、创伤修复期组织中)均发现有VEGF的表达。多种细胞分泌VEGF,特异性作用于内皮细胞上的VEGF受体,调节内皮细胞有丝分裂、血管通透性、血管紧张性,还可促进胚胎期血管形成并影响多种血管活性分子的产生。在多种病理情况下,可出现VEGF异常表达,如在缺血性疾病中,缺氧可刺激VEGF表达上调,通过VEGF对内皮细胞的强烈促有丝分裂作用,促进新生血管形成,改善组织血供,在肿瘤中多种因素影响VEGF表达,促进细胞增殖迁移,诱导血管形成,促进肿瘤生长,并提高血管通透性,引起周围组织纤维蛋白沉着,促进单核细胞、成纤维细胞及内皮细胞浸润,有利于肿瘤基质形成,使肿瘤细胞渗入新生血管,促进肿瘤转移[63]

    VEGF受体与胰岛素受体类型相似,同属于酪氨酸蛋白激酶受体家族,目前至少3种酪氨酸激酶fltlflklKDRfit4被确认为VEGF受体,其中fltlflklKDRVEGF高亲和力受体。正常情况下多种组织中均能表达fltlflkl,在胎盘、脑、心和肺中fltl mRNA占优,而flkl mRNA主要存在于心、肺、脾、肾。高亲和力受体主要表达于内皮细胞,少量表达于造血细胞、单核细胞,而只有内皮细胞对VEGF产生应答。

22 VEGF基因表达的调控机制

   缺氧、多种细胞内介质、类固醇激素、各种肽类生长因子均可通过控制基因转录,影响VEGF基因表达。Das等(2005[64]的实验表明,缺氧可通过增加VEGF基因转录率和VEGF mRNA稳定性引起VEGD基因表达上调。另外,在缺氧时还观察到一个与信号传导通路有关的现象,即缺氧可以诱导f0sjun家族基因的表达,jun家族的同二聚体或fosjun异二聚体构成的AP1(激活蛋白1)转录因子,其在VEGF表达调控方面起重要作用。VEGF基因转录启动子区域有4AP1结合位点,当vf0scjun共同表达时可刺激VEGF转录。在对诱导VEGF表达的细胞内信息通路进行研究时发现,细胞内介质调控途径如下:当某些细胞癌变时,RasSrc致癌基因的产物酪氨酸激酶可促进二酰甘油(DAG)生成,DAG又是PKC的生理激活剂,活化后的PKCRas蛋白复合体能激活Raf 1,激活的Raf可引起一系列激酶级联反应,依次激活Erk/.APKErk进入细胞核内磷酸化,通过激活cjun的转录活性和诱导cf0s表达,最终影响AP1合成,AP1VEGF基因转录启动子区域4AP 1结合位点结合,促进VEGF的转录。Ras蛋白和酪氨酸蛋白激酶可诱导信号通路持续活化,引起VEGF基因转录增加,稳定性增强。在灵长类动物子宫内膜上,VEGF mRNA水平受类固醇激素调节,而抗孕激素可抑制VEGF表达,VEGF启动子中缺乏类固醇反应元件,因此雌激素往往通过非直接方式诱导VEGF表达,其途径是雌激素可诱导c-juncfos基因转录,加强AP 1转录因子复合体的形成,最终激活VEGF转录。另外,雌激素和孕酮可以促进乳癌细胞产生磷酸肌醇和卵磷脂,这些物质是包括DAG在内的多种第二信使的前体,磷脂总量增加可使PKC更易被激活,从而激活信号传导通路。另外,许多肽类生长因子可促进VEGF的表达,TGFI3可诱导VEGF在平滑肌细胞、成纤维细胞表皮细胞中表达,还可诱导PDGFbFGF表达,成为VEGF增效剂。在神经胶质瘤细胞中,TGFc~EGF可诱导VEGF表达,这2种生长因子通过EGF受体传递信号,诱导酪氨酸磷酸化并激活Ras,促进VEGF表达。PDGF在人血管平滑肌细胞中可诱导VEGF mRNA表达,这种效应通过PKC途径实现。

3 胰岛素受体对VEGF表达的调节

31 对视网膜VEGF表达的调节 近年来,关于胰岛素信号在视网膜作用的研究主要集中在糖尿病视网膜病变发生机制的研究上。糖尿病视网膜病变在发达国家是成人致盲的重要原因[65],已知糖尿病视网膜病变发生的主要原因是高血糖导致的血管通透性增高、内皮细胞增殖和新生血管形成。人类糖尿病视网膜病变和实验性胚胎视网膜病模型的研究发现,VEGF有过表达现象[66]。同时部分临床研究

证实,强化胰岛素治疗可能引起一些病人的视网膜病变恶化。探讨这些现象的机制发现,内皮细胞上的胰岛素信号可以调节与新生血管形成有关的一些介质的表达,如VEGFeNOS等。Tatsuya等(2003[67]的动物实验发现,在相对缺氧状态下,血管内皮细胞胰岛素受体基因敲除(VENIRKO)组视网膜VEGF的表达较对照组明显降低(34),同时视网膜新生血管形成也较对照组明显减少,提示胰岛素信号途径可能通过活化VEGF而在视网膜新生血管形成中起作用。Ming等(1999[53]研究了在体及离体状态下胰岛素对视网膜VEGF表达的影响,结果表明在体状态下,胰岛素增强了VEGF mRNA在神经节、视网膜色素上皮(RPE)细胞层的表达,且增强了VEGF启动子的活性,但不影响转录稳定性;胰岛素还可以使离体培养的RPE细胞的VEGF蛋白水平呈剂量依赖性表达增高。用胰岛素干预培养的RPE细胞能刺激毛细血管内皮细胞增生,而这一作用能被抗VEGF抗体完全阻断。因此,胰岛素能通过增强VEGF基因的转录,从而提高RPE细胞VEGF mRNA和分泌性蛋白的表达;强化胰岛素疗法可能是通过提高视网膜VEGF的表达从而引起糖尿病病人视网膜病变短暂性恶化。

32 对肿瘤组织VEGF表达的调节

     Matthias等(2004[57]证实,胰岛素样生长因子受体(IGF1R)能上调胰腺癌细胞上VEGF的表达,胰岛素受体底物.1和一2(IRS1和.2)作为IGF1R2个主要的下游分子,在促肿瘤血管新生中起重要作用。这2IRS蛋白可通过几种不同的途径来调节VEGF表达。Spl(一种锌指转录因子,可促VEGF转录)一依赖性的VEGF转录主要通过IRS2来调节,胰腺癌细胞中的蛋白激酶c作为一种开关元件在Spl一依赖性的VEGF转录过程中起重要作用,蛋白激酶一C能引起Spl一依赖性的VEGF转录,同时对IRS2还有负反馈抑制作用。这表明在胰腺癌上皮细胞中,Spl一依赖性的VEGF转录是受IGF1R(通过IRS2蛋白信号途径)控制的,并受蛋白激酶cIRS2负反馈作用的调节。此外,结果还表明IRS可以通过磷脂酰肌醇_3激酶途径促VEGF在胰腺癌细胞中表达。在肾癌细胞的研究中[68]发现,RASMAPK途径对VEGF表达起重要作用,这类细胞中PKC可被Ras激活,启动MAPK系列酶联反应,继而引起VEGF转录,而在胰腺癌细胞中没有发现RasVEGF转录产生影响。提示不同的癌细胞中存在不同的VEGF调节机制。

33 对其他组织细胞VEGF表达的调节

     ClauDia2000)[69]在对体外培养细胞的研究中发现,胰岛素可以通过多种不同的信号途径诱导VEGF mRNA表达。体外培养的可表达人胰岛素受体(NIHIR)NIH3T3纤维原细胞给予胰岛素干预4 h后,培养细胞的VEGF mRNA量增加了6倍,干预24 hmRNA表达仍能维持同等的增高水平。用PI3K抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)对细胞进行预培养,能降低胰岛素对NIHIR细胞VEGF mRNA的促表达作用;同时,NIHIR细胞上活化的蛋白激酶B(PKB)的表达也能够诱导VEGF mRNA的表达。Zhen(2003)[70]报道,胰岛素在对VEGF表达的调节中具有多信号途径特点,能使培养的大鼠大动脉平滑肌细胞的VEGFmRNA水平从10-9增高到10-7,其中VEGF2个表达高峰均能被LY294002(一种PI3K抑制剂)所抑制,也能被PI3K消极亚单位或Ras消极亚单位过表达所抑制。PI3K途径对VEGF表达的重要作用,在从IRSl基因敲除鼠分离的动脉平滑肌细胞中得到了证实,这种敲基因鼠的培养细胞经胰岛素刺激后VEGF的表达和PI3K的活性水平较正常鼠分离细胞胰岛素刺激后下降了46% 一49%。因此,在大动脉平滑肌细胞中,胰岛素能通过IRS1PI3K瀑布和RasMAPK途径调节VEGF的表达。

    VEGF是一种特异性的血管生长调节因子,具有特异性促进内皮细胞增殖,增加血管的通透性,改变细胞外基质的作用。在胚胎发育、创伤修复等生理情况下及炎症、增殖性糖尿病性视网膜病变、肿瘤生长、视网膜中央静脉阻塞、早产儿视网膜病变等病理情况下都与血管的形成和增生有密切关系[71]。在增殖性视网膜病变(proliferative diabeticretinopathyPDR)中,VEGF通过作用于视网膜血管内皮细胞上大量高亲和力受体,促进血管内皮细胞的分裂、增殖,进而导致视网膜新生血管的生成[72]

汤学夫等(2006)血清IGF1VEGF水平与糖尿病足关系的研究中发现,糖尿病足患者血清胰岛素样生长因子一1(insulinlike growth factor1 IGF1)VEGF水平显著低于糖尿病患者和健康成人水平[73]。也有临床和动物实验资料表明:糖尿病足患者患肢骨骼肌血管内皮生长因子基因表达水平明显低于非糖尿病下肢动脉粥样硬化闭塞症患者[74];糖尿病大鼠创面VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factorbFGF)的表达在伤后各时相点显著低于正常对照组大鼠,且表达明显滞后[75]。由于缺血肢体内VEGF基因表达减少,引起糖尿病足闭塞血管周围侧支血管明显减少,侧支代偿不足,缺血性溃疡持续进展且难以愈合,这可能是引起糖尿病足部溃疡的重要原因。

    综上可知既往对VEGF的研究主要集中在其与肿瘤发生与发展、缺血性血管病变、糖尿病小血管异常增生的关系、作用机制、影响因素及治疗等方面[76]。但随着研究的深入,胰岛素受体及其底物表达变化与VEGF及其促血管新生作用之间的关系逐渐受到人们的重视[77]。目前多数研究者认为, 胰岛素、胰岛素受体及其底物可通过多种信号途径诱导VEGF的表达,其中研究较多的有胰岛素受体底物-1 ( IRS-1) / 磷脂酰肌醇-3 激酶( PI-3 K) 瀑布、Ras-MAPK途径等[78]

    因此,由上可知胰岛素通过胰岛素受体及其底物表的变化在血管内皮生长因子(VEGF)的作用机制中可能存在着某种相关机制,故通过本实验去证实并探讨胰岛素是否有上调血管内皮生长因子(VEGF)水平的作用,进一步启示胰岛素治疗慢性创面的作用机制。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

      

   实验 胰岛素局部应用对大鼠慢性创面愈合的影响及初步探讨

  

   胰岛素(insulinIN)是一种蛋白质类激素,主要由胰岛β细胞分泌。既往的研究表明胰岛素具有多种生物学作用,能够促进蛋白质合成、纠正负氮平衡,临床上主要用来治疗糖尿病,也用来治疗缺血性脑血管病等[1112]。有研究显示,胰岛素可参与创面愈合过程炎症反应阶段多个环节的调控,在局部组织的释放可以促进内皮细胞的分裂。近年来关于胰岛素和血糖调控对热力烧伤创面的影响日益受到重视,已见一些研究资料中报道。值得注意的是国内一些作者纷纷报道胰岛素局部应用可促进创面愈合,国外也有个别报道用胰岛素凝胶治疗大鼠皮肤溃疡的报道。然而,如果确实有效的话,应在何时用,用量是多少,尤其是局部应用的作用机制是什么?这些问题尚缺少实验依据,有待回答。本实验拟采用大鼠皮肤慢性创面模型,初步观察局部应用外源性胰岛素后创面血管形成和VEGF水平的变化情况,为进一步探讨其作用机制作准备。

1   材料和方法

1.1 实验动物:清洁级SD大鼠45只,体重250-300克,健康无皮肤损伤,雌雄不限,(第四军医大学动物中心提供)。

1.2 主要试剂及仪器:

1.2.1  ISOGEN-LSRNA快速提取试剂盒(日本富山基因公司)

1.2.2  SuperScriptTM反转录第一链合成试剂盒(美国Invitrogen公司)

1.2.3  显微手术器械(美国Kent Scientific公司)

1.2.4  TGL-16C型高速离心机,(上海安亭科技有限公司)

1.2.5 IS-5500凝胶成像系统(美国Alpha Innotech公司)

1.2.6  PE2400PCR(瑞士Perkin Elemer 公司)

1.2.7  SORVALL Super T21高速低温离心机(瑞士Kendro公司)

1.2.8  计算机辅助图像分析系统(日本Olympus公司)

1.2.9   组织脱水机                          徕卡TP1020

1.2.10  石蜡包埋机                          徕卡EG1150

1.2.11  切片机                              徕卡RM2235

1.2.12  摊片机、烤片机                      徕卡配套设备

1.2.13   正置显微镜                          Axioskop 40

1.2.14   数码超声清洗仪                      CD-380A

1.3  实验分组及动物模型制作

1.3.1实验分组:SD大鼠随机分为对照组(A组)、胰岛素4单位组(B组)和胰岛素8单位组(C组),每组15只。

1.3.2 动物模型制作:大鼠用1%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(25mg/Kg),麻醉显效后以褪毛剂去除大鼠背部毛发,常规碘酒、酒精消毒,铺巾:以大鼠脊柱为中心,旁开1cm,分别在大鼠背部左、右侧设计一长8cm,宽2.5cm的双蒂皮瓣,从肌膜浅层掀起并原位缝合并打包固定。1周后在皮瓣中心部位切除直径2cm圆形全层皮肤,形成创面,暂用生理盐水湿纱布覆盖。(见图1-4

1.4 创面治疗:治疗组创面分别用4单位和8单位胰岛素加入2ml无菌生理盐水中,用43cm╳3cm的纱布渗透覆盖创面,外层再用单层油纱布和5层干纱布覆盖,为防止敷料移位和滑脱,用0号丝线将敷料缝合打包固定,在创周皮肤外面再用弹力绷带包扎固定。对照组创面方法同上,创面仅用油纱布和5层干纱布覆盖。此外,为防止大鼠自残创面,用自制大鼠背心限制大鼠颈部活动。隔日换药1次。(见图5

1.5创面面积的测定:各组5只,术后第8 d用无菌透明载玻片覆盖创面,用记号笔沿创面边缘描绘出创面,再用平整厚度均匀的透明塑料膜复制并剪下该创面图样,以万分之一电子分析天平测定透明塑料膜图样的质量,并换算成相应创面的面积(首先测定透明塑料膜单位面积的质量,mg/cm2)。

1.6血糖测定及病理学检查:

1.6.1血糖测定:各组5只,制模后第8 d测每只大鼠的血糖值。

     方法:大鼠眼球取血,血糖仪测试。

1.6.2病理学检查:

术后第8 d,每组取5只大鼠断头处死,分别在创面中心区及创面内边缘区域取直径1 cm,厚度3 mm的区域作为组织标本,用10%福尔马林溶液固定48h常规处理,HE染色,光镜下观察病理变化。具体如下:

1 脱水 采用全自动密闭式脱水机对组织进行脱水。

2 包埋 将熔化的石蜡注入包埋托内(模具),而后用镊子将经过浸蜡的组织块从脱水盒中取出,放入包埋托中央,放在小冷台上,用镊子轻按组织块,以达到组织块平整,盖上脱水盒底,再加好石蜡,移至冷冻台上,待冷冻好后,卸下组织蜡块待切。包埋时应根据组织的不同,选择大小型号适合的包埋托;有要求直立包埋的组织要用镊子将组织固定在蜡块中央稍停片刻,以使组织在蜡凝时立住,达到立埋的要求。

3)切片

切片前的准备:清洗过的载物片(或免清洗的),毛笔,铅笔,小竹片,水槽,雾化器,摊片器,切片刀,刀架。
切片制作步骤:刀架的粗削部放在头端,在切片机刀架部夹紧。组织蜡块装在切片机蜡块固定器上夹紧。右手握切片机刀头运动手柄,左手转动切片机蜡块运动旋钮。先转动此钮,后平拉刀架运动手柄,进行粗削,直至组织切全。停止,将刀架移到细削部,轻轻转动蜡块运动旋钮,后拉刀架手柄进行细削。削至组织光滑发亮,右手拿毛笔扫净刀架及蜡块上的蜡屑,组织屑,放下毛笔,再用右手握住刀架运动手柄。左手拿小竹片,用竹片头蘸一下水槽中的水。左手中指搬动薄切钮,雾化器的喷头对准蜡块。右手拉刀架运动手柄。左手中的小竹片在蜡块空白处等待切片刀切起蜡片一端挑起粘住,随切片刀移动,完整的蜡片切出后,粘在竹片上,移入水槽中,捞片,放在摊片器上摊片5 min后,装在染色篮上,放入75℃烤箱烤片。

4HE染色

人工染色程序液体设置

75℃恒温烤箱烤片20 min

二甲苯I

25 min

二甲苯

25 min

二甲苯

25 min

无水乙醇I

1min

无水乙醇

1min

95%乙醇I

1min

95%乙醇

1min

85%乙醇

1min

10

80%乙醇

1min

11

70%乙醇

1min

12

自来水水洗3次,将水控净

13

苏木精

5min

14

自来水水洗3

15

l%盐酸乙醇分化

35s

16

自来水水洗3

17

O5%氨水返蓝

18

自来水水洗3

 

1.7创面组织切取及VEGF检测(RT-PCR

1.7.1创面组织切取:各组5只,取第8 d创面中心区直径1 cm,厚度3 mm的区域作为组织标本,立即用液氮速冻,48 h后转入-70 ℃冰箱冻存,冻存时间不超过3个月。

1.7.2VEGF检测(RT-PCR):

①提取总RNA:按照ISOGEN-LSRNA快速提取试剂盒说明提取总RNA

反转录合成cDNA:依照SuperScriptTM反转录第一链合成试剂盒的说明进行。引物合成:VEGF的特异性引物由上海生工生物公司合成,其寡核苷酸引物序列为:5’-GCTCTCTTGGGTGCACTGGA-3’5’-CACCGCCTTGGCTTGTCACA-3’,产物大小为635 bp;β-actin引物序列5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA-3’5’-CATCGGAACCGGTCATTGCCGATAG -3’ ,产物大小为298 bp

RT-PCR扩增:在50 μL反应体积中加入0.2 μg合成的cDNA5 μl 10×PCR缓冲液、5μl 1 mmol/LMgSO415 pmol的引物,16.67 nkatKOD-Plus-DNA聚合酶。使用PTC-100 PCR仪进行热循环。取10 μl PCR产物,经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后,用凝胶成像系统进行照相,并与内参照β-actin条带进行对比,计算各阳性条带的相对密度值。

1.8统计学处理:数据用(x±s) 表示,各组间比较应用方差分析。

 

2                 结果

2.1 创面面积和创面愈合率的计算结果

    创面愈合率=原始创面面积—剩余创面面积/原始创面面积

术后第8天,创面原始面积为3.14±0.10 cm2A组创面面积为2.5±0.13 cm2B组创面面积为2.05±0.09 cm2C组创面面积为1.98±0.13 cm2A组与B组和C组相比,有明显统计学差别(P < 0.05);而B组和C组之间无统计学差别(P > 0.05)。A组创面愈合率为20.38±4.06 %B组创面愈合率为34.71±2.89 %C组创面愈合率为36.94±5.41%A组与B组和C组相比,有明显统计学差别(P < 0.05);而B组和C组之间无统计学差别(P > 0.05)。见图(6

2.2 血糖测定及病理检查结果

术后第8天血糖值显示,术前正常大鼠为:10.63±0.24 mmol / LA组为10.86±0.38 mmol/ LB组为9.84±0.58 mmol/ LC组为9.69±0.43 mmol/ LA组与B组和C组相比,有明显统计学差别(P < 0.05);而B组和C组之间无统计学差别(P > 0.05);B组和C组较A组创面肉芽组织形成更明显,创面内毛细血管数目更多。B组和C组之间则无明显差异。见图(7-8

2.3  RT-PCR结果

A组相比,B组和CVEGF mRNA表达有明显增高的趋势(P < 0.05),CmRNA表达略高于B组的VEGF mRNA表达,但两组之间无明显统计学差异(P > 0.05)。各组VEGF mRNA表达比较见图(9-10)。

 

3   讨论

血液中的胰岛素主要由胰岛β细胞分泌,对于生物的生存至关重要,具有多种生物学效应,在线虫、鱼类和哺乳动物中发挥相似作用,胰岛素的缺乏可以导致人在在几天、至多数周内死亡[76]。最近的研究表明,胰岛素是一种与代谢相关的重要蛋白,可以调节肝脏、脂肪细胞和骨骼肌的代谢,促进这些组织和器官对糖的摄取。胰岛素也可以由局部的组织如皮肤产生,并在局部和全身发挥作用[80]。有研究证明,胰岛素注射液局部外用治疗皮肤感染或其它原因而引起的创面延期愈合的患者取得良好的疗效[15]

唐月学等(2007)通过大剂量胰岛素和生理盐水外敷治疗压疮患者同样取得良好的效果,并认为采用8 Uml胰岛素生理盐水液外敷治疗压疮是相对安全的[19];有报道认为,胰岛素与庆大霉素、甲硝唑混合湿敷对治疗糖尿病足坏疽长期不愈合具有明显的效果[20]胰岛素联合硫酸庆大霉素治疗由于脑血管疾病、糖尿病、心衰等所导致的褥疮也具有明显效果[17]付小兵等(1999)在表皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子促进创面修复效应的比较性研究的报道中认为胰岛素促进创面愈合机制为:胰岛素的成纤维细胞生长因子样作用可以刺激成纤维细胞复制,促进成纤维细胞生长增殖。机能活动加强,使成维细胞大量增殖,并合成大量胶原纤维,迅速使创面上皮化,促进创面愈合。胰岛素可以加速糖的无氧代谢,为成纤维细胞的生长增殖提供能量,促进创面毛细血管增生,使组织快速血管化,增加血流量,加快伤口愈合。增加蛋白合成的功能在促进创面愈合过程中发挥着重要作用[22]这些研究说明胰岛素的局部应用对治疗慢性创面具有良好的临床效果。然而,胰岛素局部应用治疗慢性创面的具体作用机制仍有待进一步研究和明确。

近来的研究发现,胰岛素可以作为一种丝裂原在血管系统的分化、生长和存活方面发挥重要作用[81]。并且有报道采用SD大鼠制作Ⅲ—Ⅳ°压疮模型,在创面外用不同剂量的胰岛素进行治疗,观察组织氧分压和pH值、血糖值、创面肉芽生长情况及愈合后组织形态等改变,结果表明胰岛素不仅能够促进成纤维细胞、上皮组织和毛细血管增生以及胶原合成,提高压疮区组织氧分压和pH[21]。我们的研究以大鼠难愈性创面模型为研究对象,局部应用不同剂量的胰岛素进行治疗,结果:和对照组进行比较,治疗组应用胰岛素进行治疗后,创面面积明显缩小,肉芽组织形成明显增多,创面组织内成纤维细胞、毛细血管数目更多。

血管内皮生长因子VEGF是一种特异性的血管内皮细胞有丝分裂原, 与血管内皮细胞上VEGF 受体结合后, 能引起内皮细胞分裂、增殖和迁移, 增加血管通透性, 促进新生血管形成[53]Nishimura T2006)等在研究中发现血管内皮生长因子是强效的促内皮细胞有丝分裂原,新生血管的增加保证了细胞增殖、组织修复所必需的氧和营养物质的供给,对肉芽组织生长中有重要作用[41-43]。另外血管内皮生长因子可以调节细胞外基质,使其有利于细胞生长。如激发Ⅷ因子从内皮细胞释放,诱导基质胶原酶在内皮细胞表达等[44] Altavina D等(2001)对瘢痕机制研究认为,血管内皮生长因子可以通过某种机制调节成纤维细胞的活性,影响胶原的代谢[45]。彭湃等(2007)在纳米微囊一血管内皮生长因子复合体对创伤组织中Bcl·2CD34表达的影响的研究结果支持了以上研究发现,认为血管内皮细胞生长因子的缺乏可能是慢性创面微血管生成障碍的一个重要机制,以及血管内皮细胞生长因子还可能通过对细胞外基质的合成及分泌的调节作用而影响创面的愈合[44]既往对VEGF的研究主要集中在其与肿瘤发生与发展、缺血性血管病变、糖尿病小血管异常增生的关系、作用机制、影响因素及治疗等方面[76]。并发现在胚胎发育、创伤修复等生理情况下及炎症、增殖性糖尿病性视网膜病变、肿瘤生长、视网膜中央静脉阻塞、早产儿视网膜病变等病理情况下都与血管的形成有密切关系[71]。在增殖性视网膜病变(proliferative diabeticretinopathyPDR)中,VEGF通过作用于视网膜血管内皮细胞上大量高亲和力受体,促进血管内皮细胞的分裂、增殖,进而导致视网膜新生血管的生成[72]。汤学夫等(2006)血清IGF1VEGF水平与糖尿病足关系的研究中发现,糖尿病足患者血清胰岛素样生长因子一1(insulinlike growth factor1 IGF1)VEGF水平显著低于糖尿病患者和健康成人水平[73]。也有临床和动物实验资料表明:糖尿病足患者患肢骨骼肌血管内皮生长因子基因表达水平明显低于非糖尿病下肢动脉粥样硬化闭塞症患者[74];糖尿病大鼠创面VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factorbFGF)的表达在伤后各时相点显著低于正常对照组大鼠,且表达明显滞后[75]。由于缺血肢体内VEGF基因表达减少,引起糖尿病足闭塞血管周围侧支血管明显减少,侧支代偿不足,缺血性溃疡持续进展且难以愈合,这可能是引起糖尿病足部溃疡的重要原因。随着研究的深入,胰岛素受体及其底物表达变化与VEGF及其促血管新生作用之间的关系逐渐受到人们的重视[77]。目前多数研究者认为, 胰岛素、胰岛素受体及其底物可通过多种信号途径诱导VEGF的表达,其中研究较多的有胰岛素受体底物-1 ( IRS-1) / 磷脂酰肌醇-3 激酶( PI-3 K) 瀑布、Ras-MAPK途径等[78]。我们的研究证实,同对照组进行比较,治疗组在应用胰岛素进行治疗后,创面皮肤组织中的VEGF mRNA表达明显上调。这一结果是对外用胰岛素治疗慢性创面机制的进一步完善。表明胰岛素对皮肤创面愈合的促进作用是多方面的。

创面愈合是机体对损伤反应一个复杂而有序的生物学过程,影响创面愈合的因素很多。因此慢性创面的治疗具有一定的难度,但随着人们对其形成机制的深入了解,人们将会找到各种不同的治疗方法。本研究通过实验证实:大鼠背部慢性创面局部应用胰岛素治疗后,创面毛细血管增生明显增加。特别是证实了胰岛素可以通过上调VEGF mRNA,增加毛细血管数量,促进创面愈合,这对进一步了解胰岛素促进慢性创面愈合的作用机制有一定的启示,具有参考价值。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                   1大鼠背部皮肤脱毛后(像距40cm

 

 

 

 

                  2大鼠背部双蒂皮瓣(像距20cm

 

 

                   3皮瓣掀起后打包加压包扎(像距20cm

 

        4手术切除直径2cm的全层皮肤缺损(像距20cm

            5 大鼠术后包扎固定及自制大鼠背心(像距40cm

 

 

       A                     B                 C

               6术后创面第8天各组创面面积对比(像距20cm

 

 

 

     A                   B                 C

     7术后第8天各组创面中心组织毛细血管数目对比(A组最少,B组和C组较多,但后两者之间无明显差别)

 

 

         A                   B                 C

     8术后第8天各组创面边缘组织毛细血管数目对比(A组最少,B组和C组较多,但后两者之间无明显差别)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

actin

VEGF

          9  术后8天各组创面组织VEGFRT-PCR结果

10术后8天各组创面组织VEGFRT-PCR结果对比图

 

 

 

结 论

1. 局部应用胰岛素治疗后,创面毛细血管增生明显增加

2. 胰岛素可以通过上调VEGF mRNA,增加毛细血管数量促进创面愈合

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

参考文献

 

[1]Ramasastry SS.Chronic problem wounds. Clin in plast Surg.1998;25(3):  367-396

[2]Robson MC. Wound infection: afailure of wound healing used by an 

  imbalance of bacteria. Surg Clin North Am.1997; 77: 650

[3]Kirsner RSEaglstein WH. The wound healing Proeess.Dermatol 

  Clin.1993; 11:629-640

[4]Wagner VHKeagy AAKottb MMet al. Noninvasive determination

  of healing of major lower extremity amputations: The combined role of 

  clinical judgement. J Vase Surg. 1988;8:703-710

[5]Sheffield PJ. Tissue oxygen measurement with respect to soft tissue

  wound healing with normobarie and hyperbaric oxygen. Hyperbaric

  Oxygen Rev.1955; 6: 18-46

[6]Falanga V, Grmnell FGilchrest Bet al. Experinental approaches to chronic wounds. Wound Repair and Regeneration.1995; 3: 132-140

[7]HopfHWHunt TKWest JMet al. The effect of ambient oxygen tension predicts 

  the risk of woung infection in surgical patients. Arch Surg 1997 Sep;132(9):997-

  1004

[8]Lek SD. Experimental staphylococcal infections in the skin of man. Ann NY Acad

  Sci 1956;65:85-90

[9] Burke JMile A. The sequence of vasurlar events in early infective i

   nflammation. J Pathlo 1958; 76:1-19

[10]Hohn DMackay MHalliday B et al. Effect of O2 tension on microbicidal

   function of lrukocyte in wounds and in vitro. Surg Forum 1976;27:1820

[11]Bering BDevendra D. Intensive insulin therapy in patients with type 2  

  diabetes. Lancet. 2008; 372(9640)716-717.

[12] Hui LPei DSZhang QGGuan QHZhang GY. The neuroprotection of insulin on ischemic brain injury in rat hippocampus through negative regulation of JNK signaling pathway by PI3K/Akt activation. Brain Res. 2005 Aug 2;1052(1)1-9.

[13] Pierre EJBarrow  REHawKins HKet nl. Effects of insulin on wound healing.J Tranma,1998,44:342-345.

[14]王伟,解震河,表皮生长因子配伍胰岛素在糖尿病慢性伤口愈合中的作用。河南诊断与治疗杂志,2001,15:198-199

[15]王卫红,马春燕  外用胰岛素治疗创面延期愈合2 1 3例临床观察中华现代中西医结合 文章编号:181ll998(2004)O20098O2

[16]陆建芝 胰岛素创面换药治疗糖尿病溃疡 浙江创伤外科。2001,6(3): 146

[17] 施庆忠 赵景轩 钱伟靖王成艳 硫酸庆大霉素加胰岛素外敷治疗褥疮32

实用医药杂志 2007,3(3): 313

[18]蔡敏纯 胰岛素辅助治疗慢性难愈合创面60例疗效分析  临床和实验医学杂

      2008,7(11):84

[19]唐月学,曾志.不同剂量胰岛素外敷治疗压疮疗效观察[J].中国康复理论与实践,2007,13(11):109

[20]卜秦琍, 孙洪芳. 654-2加胰岛素、庆大霉素、甲硝唑混合液湿敷治疗DM  坏疽. 临床荟萃. 1999, 14(3): 120

[21] 王德强, 夏仁云.局部应用胰岛素促进压疮创面愈合的机制. 中国康复.      2006, 21(1): 18-20

[22] 付小兵,孙同柱,王亚平,等.表皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长 

     因子促进创面修复效应的比较性研究[J].中国修复重建外科杂志,1999 

     13(5):278282

[23]柳晖 陈武鹏 向红霞 胡检 李新强 张显文 胰岛素与重组人表皮生长因子

    局部联合应用对大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合的影响。实用医学杂志200925(3):

359

[24] 刘琰,章雄,张志,等.局部应用胰岛素对烫伤大鼠创面愈合的影

[J].中华烧伤杂志,200420(2):3639

[25] Ferrara NHenzel WJPituitary follicular cells secrete a novel

heparinbindinggrowth factor specific for vascular endothelial

eelIs8iochem biophys Res CornmMn 198916ll2)8518

[26]Leurg DWCachianes GKuan g WJet Vasculaf endothelial growth         

   factor is a secreted angiogenic mitogenScience 1989246(4935)   

   13069

[27] Connolly D R, Olander J V, Heuvelamn D, et al  Human vascular permeability

    factor: isolation from U937 cell  J Biol Chem 198924620017-20024

[28] Dvorak H F, Brown L F, Detmar M, et al  Vascular permeability factor/vascular enthelial growth factor, mcirovascular pyperpermeability, and angiogenesis  America Journal of Pathology  1995146(5)1029

[29]  Fezrara NGerber lipThe role of Vascular Endothelial Growth  

     Fac·tot in Angiogenesis[J]Acta Haematol2001106(4)148-156

[30] Michael DGMaria AOVascular repair after Menstruation   

     involvesRegulation of Vascular Endothelial Growth Factor 

     Receptor Phos·pborylalion by FLT·1[J]Am J Patho2001158(4)

     1399-1410

[31] Nicolas GGannela AExpressionproduction and secretion of V·

    and Intedeukin-6 by Grsndesa Cells is Comparable in WomenWith

    and Without Endometriesis[J]Fertility Sterility200176(3)

    568-575

[32] Homer ABord STie2 Ligands Angiopoietin-1 an d Angiopoietin-2

Are Coexpressed with V·in Growing Human Bone[J]Bone200128(1)    

65-71

[33] Nagy JA Vasile E Feng D et a1Vascular permeability factorvascular en-

  dothelial growth factor induces Iyrnphangiogenesis as well as ungiogenesisJ Exp

  Med 2002196(11)1497—506

[34] Zhang DGai LFan R et a1Eficacy and safety of therapeutic angiogenesis

   from direct myocardial administration of an adenoviral vector expressing vascular

   endothelial growth factor 165Chia Med Jf g~g1)2002ll5(5)643—8

[35] Masaki IYonemitsu YYamashita Aet a1Angiogenic gene therapy for ex-

   perimental critical limb ischemiaacceleration of limb los by overexpression of

   vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growt h factor2Circ

   Res 200290(9)966—73

[36] Bouis D Boelens MC Petets E et a1Combination of vascular

   endothelial growth factor(VEGF)and thymidine phosphorylase (TP) to

   improve angiogenicgene therapy Angiogenesis 2003;6(3): 193-9

[37] Hiasa KEgashira KKitamoto Set a1Bone marrow mononuclear cel therapy

   limits myocardial infarct size through vascular endothelial growth factorbasicRes

   Cardiol 200499(3)165—72

[38]Taub PJMarmul JDZhang WXet alLocally administered vascular endothe-

  1ial growth factor cDNA increase survival of ischemic experimental skin

   flapsPlast Reconstr Surg 19981022033—9

[39] Hiasa KEzashim K tamoto  SeI alBone mamrrow mononuclear cell therapy limits myocardial infact size throuth vascular endothebal growth factorBasic ReI Cardiol 200499(3)165—72

[40]Ward WKWood MDCasey HMet  alThe effect 0f local subcutaneous deliv-

   ery of  vascular endothelial growth factor on the function of a chronically implanted ampemmetric  glucose sensorDiabetes Technol Ther  20046(2)137—45 ‘

[41] Nishimura T Hashimoto H Nakanishi l et al. Microvascular

     angiogenesis and apo ptosis in the survival of free fat grafts

     Laryngoscope 2000110(8)13331338

[42] Saadsto A Tammela T Farkkila Aet a1Vascular endothelial  

     growt h factor-C accelerates diabetic wound healingAm J Pathol 

     2006169(3)10801087

[43] Neumeister MW Song YH Mowlavi A et a1Efects of liposome- 

     mediated gene transfer Of VEGF in ischemic rat gracilis

     muscleMicrosurgery 200121(2)58-62

[44]彭湃,场力,宋保强,夏文森,张卫民  纳米微囊一血管内皮生长因子复合 

体对刨伤组织中Bcl·2CD34表达的影响【J】.中国组织工程研究与临床康

复,200711(18)35683572

[45] Altavina D Saitta A Cucinotta D et a1 Inhibition of lipid  

     peroxidation restores impaired vascular endothelial growt h

     factor expression and stimulates wound healing and angiogenesis

     in the genetica lly diabetic mouseDiabetes 200150(3)667-674

[46] Dvorak HK Anglogenesis update 2005[J]J ThrombHaemost2005 

     3 (8)18351842

[47] Bates DO Jones ROThe Role of vascular endothelial growth

     factor  in wound healing [J]Int J Low Extrem Wounds20032(2)

     107120

[48]CornelCJSiddiquiA Wuk et a1 vasctllar endothelial growth

factor is more important than basic fibroblastic growth factor

during ischemic wound healing [J] Arch surg1999 134200

205

[49]Wu LSiddiqui AMoms DEet a1Transforming growth factor beta 3      

   (TGF beta 3accelerates wound healing without alteration of scar

prominence Histologic and competitive Reverse-transcription- 

polymerase chain reaction studies[J]Arch Surg1997132753·760

[50]Jalali S del Pozo MAChen K'et a1 Integrin·mediated

    Mechano- transduction requires its dynamic int erection with

    specific extracellular matrix (ECM)ligands[J]Proc Nall Acad

    Sci USA200198(3)l042·l046

[51]Carmeliet P Blood vessels and nerves common signals

    pathways and diseases[J]Nat Rev Genet20034(9)710·720 

[52] Nohon KWNaoyuki OKJeanette MEet a1VEGF is major stimulator

     in model of choroidal neovascularizationJ]Invest Ophthalmol

     Vis Sci200041(10)31583164

[53] Ming LUShiro AMKazuaki MIet a1Insulininduced vascular

     endothelial growth factor expression in retina[J]Invest   

     Ophthalmol Vis Sci199940(11)32813286

[54]FIyvbjerg AGKhatir DSJensen LJet a1The involvement of

    growth hormone(GH)insulinlike growth factors(IGFs)and vas

    cular endothelial growth factor(VEGF)in diabetic kidney disease

    [J]CurrPharm Des200410(11)33853394

[55]Trisciuoglio DRIervoline AGZupi GRet a1 Involvement of

     PI3 K and MAPK signaling in bcl-2induced vascular endothelial

     growth factor expression in melanoma cells[J]Mol Biol Cell

     200520(12)4967-4974

[56] Liu RBai HLiu Yet a1Polymorphism of insulin receptor sub   

   -strate-1 gene in patients with coronary heart diseases[J]Sichuan

   DaXueXueBao YiXue Ban200334(3)427-430

[57]Matthias NEKaustubh DASusann STet a1Role of insulin receptor   

   substrates and protein kinase cin vascular perm eability factor

   vas cular endothelial growth factor expression in pancreatic 

   cancer cells[J]J Biol Chem2004279(6)3941-3948

[58] Witmer ANBlaauwgeers HGWelch HAet a1Altered expression

     patterns of VEGF receptors in human diabetic retina and in  

     experimental VEGFinduced retinopathy in monkey[J]Invest 

     Ophthalmol Vis Sci200243(3)849-857

[59] Michael SIZupi GRIervoline AGet a1Clinical trials in  

     coronary anglogenesisissuesprobIemsconsensus[J]Circulation

     2000102(9)66-73

[60] Yunjuan SKunlin JLin Xet a1VEGFinduced neuroprotection

     neurogenesisand anglogenesis after focal cerebral ischemia[J].,

     ClinInvest2003111(11)18431851

[61] RosellNovel AMontaner JAlvarezSabin Jet a1Angiogenesis   

     in human cerebral ischemia[J]Rev Neuro200438(11)10761082

[62] Cusi KMaezon KOsman A et a1Insulin resistance differentially

     afects the PI3Kinase and MAP kinase mediated signaling in human

     muscle[J]J Clin Invest2000105(3)311-320

[63] Ann HOBart LAMartin Set a1 Vascular endothelial growth

     factor and angiogenesis[J]Pharnmol Rev200456(11)549580

[64] Das BYeger H Tsuchiga Ret a1A hypoxiadriven vascular endo   

-thelial growth factorFhl autocrine loop interacts with

hypoxia-induc-ible factor-1 alpha through mitogenactivated

protein kinaseextracel-lular signal-regulated kinase 12

pathway in neuroblastoma[J]Cancer Res200565(16)7267-7275

[65] Moss SEKlein RKlein BEet a1The 14year incidence of visual

loss in a diabetic population[J]Ophthalmolog1998105(9)

9981003

[66] Poulaki VIWenying QIAntonia MIet a1Acute intensive insulin

therapy exacerbates diabetic bloodretinal barrier breakdown via

hvpoxiainducible factor1 and VEGF[J]J Clin Invest2002

109(10)805815

[67] Tatsuya KDavid VIKiyoshi Set a1Knockout of insulin and

IGF1 receptors on vascular endothelial cells protects against

retinalneovascularization[J]J Clin Invest2003111(9)1835

1842

[68] Soumitro PAKaustubh DARoya KFet a1Role of protein kinase

     Cin rasmediated transcriptional activation of vascular perm 

   eabilityfactorvascular endothelial growth factor expression[J]J 

   Biol Chem2001276(4)2395-2403

[69]Claudia MIJustin JRNathalie FIet a1Insulin an d insulin

like growth factorI induce vascular endothelial growth factor

mRNA ex-pression via diferent signaling pathways[J]J Biol Chem

2000275(28)2169521702

[70]Zhen YJZhiheng HEBenjamin LKet a1Characterization of mul-

tiple signaling pathways of insulin in the regulation of vas 

cular endo-thelial growth factor expression in vascular cells and

angiogenesis[J]JBiol Chem2003278(34)31964-31971

[71] 郑晓龙,杨新光,王为农.血管内皮生长因子与有关眼病的治疗途径研究   

     进展[J].临床眼科杂志,19997(3)209211

[72]Sueishi KHata YMurata Tet a1Endothelial and glial cell 

    interaction in diabetic refinopathy via the function of vas

cular endothelial growth factor(VEGF)[J]P0l J Pharmacol1996 

48(3)307316

[73]汤学夫 ,孙劲松 ,李红辉 ,何琴 ,柯新桥.血清IGF1VEGF      

    平与糖尿病足关系的研究 中国优生与遗传杂志,2006,14(5):22

[74]王争,张纪蔚,张柏根.糖尿病足动脉缺血患者骨骼肌血管内皮生长因子基

因表达[J].中华外科杂志,200240(7)505—507

[75]林炜栋,陆树良,青春,等.糖尿病大鼠深二度烫伤创面VEGFbFGF的表达 

规律及其与创面微血管密度的关系[J].中华医学杂志,200383(19)1702

1704

[76]Nagy JA, Benjamin L, Zeng H, Dvorak AM, Dvorak HF. Vascular    

    permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis. Angiogenesis.    2008;11(2):109-19.

[77]Karamysheva AF. Mechanisms of angiogenesis. Biochemistry. 2008;  

    73(7): 751-62.

[78]Quatresooz P, Henry F, Paquet P, Pierard-Franchimont C, Harding K,

Pierard GE. Deciphering the impaired cytokine cascades in chronic leg   

ulcers. Int J Mol Med. 2003 Apr;11(4):411-8.

[79]Beeson M, Sajan MP, Dizon M, Grebenev D, Gomez-Daspet J, Miura A, 

Kanoh Y, Powe J, Bandyopadhyay G, Standaert ML, Farese RV (2003) 

Activation of protein kinase C-zeta by insulin and phosphatidylinositol-

3,4,5-(PO4)3 is defective in muscle in type 2 diabetes and impaired

glucose tolerance:amelioration by rosiglitazone and exercise. Diabetes

52:1926-1934.

 [80]Pelegrinelli FF, Thirone AC, Gasparetti AL, Araujo EP, Velloso LA, Saad   

     MJ (2001) Early steps of insulin action in the skin of intact rats. J Invest  

     Dermatol, 117:971-976.

 [81]Kawaguchi M, Koshimura K, Sohmiya M, Murakami Y, Gonda T, Kato Y(2001) Effect of insulin on nitric oxide synthase-like immunostaining of arteries invarious organs in Zucker diabetic fatty rats. Eur J Endocrinol 145:343-349.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

个人简历和研究成果

个人简历

金玉峰,男,19789月生于吉林农安,20026月毕业于第四军医大学临床医学专业,获医学学士学位。2006年攻读整形外科硕士学位,期间主要参加慢性创面的研究。

19979月-20026     第四军医大学临床医学专业,学员

20026月-20068     中国人民解放军93088部队卫生队,军医

20068月-20097   第四军医大学研究生院06硕士队,硕士研究生

 

发表文章

 

金玉峰,陈绍宗,胰岛素促进慢性创面愈合的效果及机制。现代肿瘤医学。校订待刊。

 

 


 

   

衷心感谢我的导师陈绍宗教授!本论文是在导师陈绍宗教授的严格要求和悉心指导下完成的。他治学严谨,为人师表,在科研与教学工作中取得了丰硕成绩,具有丰富的医学理论知识和临床工作经验,手术技术精湛,医德医风高尚。在我的课题设计实施、论文撰写和临床工作过程中给予我热情鼓励和细心指导,提出了大量宝贵意见。在我三年的学习和生活中给予了无微不至的关怀,为我的成长付出了巨大的心血,使我受益匪浅,铭记在心,谆谆教诲,师恩难忘!

感谢李学拥主任、李跃军副主任、李望舟副教授在我科研学习、临床工作和生活中给予了热心的帮助和鼓励!在此表示诚挚的感谢和深深的谢意!

感谢吕晓星博士、李靖博士、李金清博士、蒋立博士,孙超峰、冯剑主治医师,袁埮琴护士长,雷战军技师等给予的热情指导和大力帮助!

同时感谢唐都医院整形烧伤科全体工作人员!

最后,谨向我的家人以及所有关心、帮助我的老师、同学和朋友表示诚挚的感谢!